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病毒构建包
重组腺病毒-慢病毒构建包装服务
为促进国装
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内相关领域的研究进展，RealGene从2008年开始，对国内实验室开展重组腺病毒/慢病毒构建、包装及扩增服务，可以由客户提供自己的
基因，完成腺病毒/慢病毒构建、鉴定、包装的服务。
一、技术路线：
（一）A、腺病毒载体构建：
本系统是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA为骨架，在克隆、包装、扩增等各部条件做了改进和优化，达到了克隆阳性率更高、质量更、
包装稳定、出毒迅速、滴度高等效果。在此基础上，还拓展了更广泛的应用，可以提供各种带报告基因的，带不同标签的腺病毒构建和包装服务。
所包装的腺病毒已成功应用于信号转导，基因转位，Co-IP，动物实验，干细胞研究等科研实验。并且可以完成较高难度的克隆构建，包括具有
细胞毒性作用基因的腺病毒构建，在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。
基因，完成腺病毒/慢病毒构建、鉴定、包装的服务。
一、技术路线：
（一）A、腺病毒载体构建：
本系统是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA为骨架，在克隆、包装、扩增等各部条件做了改进和优化，达到了克隆阳性率更高、质量更、
包装稳定、出毒迅速、滴度高等效果。在此基础上，还拓展了更广泛的应用，可以提供各种带报告基因的，带不同标签的腺病毒构建和包装服务。
所包装的腺病毒已成功应用于信号转导，基因转位，Co-IP，动物实验，干细胞研究等科研实验。并且可以完成较高难度的克隆构建，包括具有
细胞毒性作用基因的腺病毒构建，在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。
- 克隆目的基因到穿梭载体（中介载体）及鉴定
根据客户提供的原始质粒信息确定克隆方案：
- 如果原始质粒与本系统所用穿梭载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片断，回收并连接到穿梭载体。酶切，测序鉴定；
- 如果原始质粒与本系统所用穿梭载体没有匹配酶切位点，设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片断，采用相应的内
切酶切下相应片断，回收并连接到穿梭载体。酶切，测序鉴定； - 对于不适用于以上方案或者有特定要求的样品，与客户协商定制具体实施方案
2）克隆目的基因到腺病毒载体pAdPL及鉴定
利用重组技术将目的片段的表达框从穿梭载体转移到腺病毒载体。
酶切鉴定阳性克隆，将阳性克隆测序二次鉴定。
B、慢病毒载体构建
慢病毒（Lent virus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，该载体可以将外源基因地整合到宿主染色体
上，达到持久性表达的效果。可地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，效果非常理想，
因此具有广阔的应用前景。
（二）病毒包装、扩增：
利用重组技术将目的片段的表达框从穿梭载体转移到腺病毒载体。
酶切鉴定阳性克隆，将阳性克隆测序二次鉴定。
B、慢病毒载体构建
慢病毒（Lent virus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，该载体可以将外源基因地整合到宿主染色体
上，达到持久性表达的效果。可地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，效果非常理想，
因此具有广阔的应用前景。
（二）病毒包装、扩增：
- 将鉴定正确的基因克隆到慢病毒载体，与辅助载体一起转染293T细胞进行包装；
- 将包装好的病毒超速离心收集；
- 将浓缩病毒进行滴定，滴定结果单位为PFU/ml（一般为5×108 PFU/ml以上，体积为500μl以上，根据客户需要，不同量有价格差异）
二、质量控制与鉴定：
- 测序鉴定
- 根据特定引物作RT-PCR鉴定
- 蛋白表达鉴定（根据客户要求并由客户提供高特异性抗体）
三、客户须知：
对于客户所要构建腺病毒的目的基因，客户须提供详细的基因相关信息，包括基因序列，载体序列，载体图谱。
载体构建步骤所需时间，根据不同构建方案，需15到25个工作日。
从合同签订之日起，客户需交纳首期技术服务费（50%服务费），方可进行实验。服务结束时一次结清余款。
客户需提供的信息及材料：
对于客户所要构建腺病毒的目的基因，客户须提供详细的基因相关信息，包括基因序列，载体序列，载体图谱。
载体构建步骤所需时间，根据不同构建方案，需15到25个工作日。
从合同签订之日起，客户需交纳首期技术服务费（50%服务费），方可进行实验。服务结束时一次结清余款。
客户需提供的信息及材料：
- 插入目的片段序列信息，原始载体序列信息，载体图谱，酶切分析图等。
- 鉴定正确的原始质粒，PCR引物及PCR鉴定方法说明（包括PCR体系及PCR条件）（非必需，或需协商），测序引物（非必需，或需协
商）。 - 原始质粒的酶切鉴定报告、测序报告，如果客户确定基因的信息无误，这条非必需。
- 实验目的、要求，目的基因有无细胞毒性，是否需要构建对照病毒？
- 实验要求包括：是否自行构建腺病毒载体？是否要求更换启动子、polyA等基因元件？
- 实验目的包括：用于细胞实验还是动物实验，需要感染的细胞类型或动物模型类型。
四、我们的：
- 构建腺病毒/慢病毒载体的时间约15到25个工作日。病毒的包装，扩增的时间约20到30个工作日。总计需要45-55个工作日。
- 提供重组穿梭载体或者siRNA载体，重组腺病毒载体的酶切及测序报告。
- 免费提供一管阴性对照（通用型的，如果客户的序列，需要另外计费）。
- 插入片段5kb－8Kb。
补充说明：
- 如果客户需更换启动子，需所插入的基因的表达产物对细胞无毒害作用，
- 如果插入的目的片段太长，客户要求测序验证全长，需要提供基因的特异引物，以测得全长，加收一定的费用。
五、腺病毒和慢病毒比较表
| 腺病毒载体系统和慢病毒载体系统比较 | | ||
| 病毒表达系统 | 腺病毒表达系统（Adenovirus） | 慢病毒表达系统（Lentivirus） | |
| 病毒基因组 | 双链DNA病毒 | RNA病毒 | |
| 复制 | 自主复制 | 自主复制 | |
| 是否整合 | 病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因 | 病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因 | |
| 感染细胞类型 | 感染分裂和不分裂细胞 | 感染分裂和不分裂细胞，适合难转染的原代细胞（如神经细胞，淋巴细胞）及体内实验 | |
| 表达丰度 | 高水平表达 | 中水平表达 | |
| 表达时间 | 快（1-2 天） | 慢 （ 1-3天 ） | |
| 滴度 | 滴度高达1011pfu/ml | 滴度可达108 pfU/ml | |
| 克隆容量 | 可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低 | 可插入不超过8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低 | |
| 免疫原性 | 高免疫原性 | 低免疫原性 | |
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