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ELISA试验中阴性的显色和阴性的本底 ELISA Kit

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上传时间:2013/6/20 9:22:23

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上 传 者:北京方程生物科技有限公司

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ELISA试验中阴性的显色和阴性的本底 ELISA Kit以常用的间接法测抗体和夹心法测抗原为例。阳性标本中含有检测系统中特异的抗体或抗原,作为桥梁联结免疫吸附剂和酶结合物,使酶结合物吸附在固相上,无色底物在酶的作用下转变成有色产物,这就是阴性的显色,显色的深度与阳性标本中待测抗体或抗原的量成正比。阴性标本中不含待测的抗体或抗原,酶结合物不能联结在固相上,故不显色。但ELISA是一个复杂的、多步骤的反应过程,反应各步中酶结合物都有可能非特异性的吸附在固相载体上,与底物反应呈现颜色,这就形成了阴性的本底。酶结合物在固相上的非特异吸附通常有以下几条途径。

o    酶结合物直接吸附在固相载体上。酶结合物是蛋白质,可以直接吸附在固相载体表面。但在ELISA试验中阴性的显色和阴性的本底 ELISA Kit这一步骤中选择了不利于这种吸附的条件,一般说来只要酶结合物工作浓度适当和反应后经过彻底洗涤,可以避免这种吸附。

o    酶结合物与固相上包被蛋白质成分起反应。包被抗原不纯时,杂质蛋白也会吸附在固相载体上,某些杂质可与酶标抗体因错认而结合。

o    在间接法中,杂抗原还有可能与血清标本中的免疫球蛋白特异或非特异地结合。另外非特异的免疫球蛋白也可吸附在包被的特异抗原上,特别是这种抗原为碱性蛋白质时,此时酶标记的第二抗体就与吸附的免疫球蛋白反应而形成阴性本底。

o    在间接法中标本中的非特异免疫球蛋白的含量远远超过特异性抗体,因此可以直接吸附在固相上,这是形成阴性本底的主要原因。聚苯乙烯对免疫球蛋白有很好的吸附性能,IgM的吸附力大于IgG,聚合IgG的吸附力大于单体的IgG。酶标记的抗Ig(二抗)对吸附在载体上的Ig和与固相抗原结合的特异性Ig有着同样的亲和力,因此在加入标本的反应中,虽然采取了不利于吸附的条件,但假设血清标本不作适量的稀释,高浓度的Ig中仍有一些能吸附在固相上,因而产生较高的本底。

o    ELISA试验中阴性的显色和阴性的本底 ELISA Kit双抗体夹心法中,标本中如含有类风湿因子,也能使阴性血清显色。类风湿因子是作用于多种动物IgG Fc段的自身抗体,多为IgM类,是一种多价抗体。在夹心法检测中充当抗原成分,同时在固相抗体及酶标抗体反应,使酶标抗体结合到载体上。

o    ELISA中引入生物素-亲和素系统可以提高检测的灵敏度,但如果使用不当,可使本底加深,反而得不偿失。生物素标记蛋白质如比例不合适,极易形成较高的阴性本底。从蛋清中提取的亲和素是一种碱性糖蛋白,可以通过静电作用吸附在聚苯乙烯上,也是造成BA-ELISA高本底的因素。从链球菌中提取的亲和素改善了这一非特异吸附现象。

 

 

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