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支原体染色测试盒使用手册
支原体染色检测试剂盒(Mycoplasma Stain Assay Kit)是一种经典的利用DNA荧光染色法检测支原体污染的试剂盒，其原理是当细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst33258染色后在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。
产品组成：
| 试剂(A): Hoechst固定液 | 50ml | RT 避光 |
| 试剂(B): Hoechst染色液 | 50ml | -20℃ 避光 |
| 试剂(C): 荧光封片剂 | 5ml | 4℃ 避光 |
| 使用说明书 | 1份 | |
自备材料：
1、 可观察蓝光的荧光显微镜或激光共聚焦显微镜
2、 PBS或生理盐水
3、 载玻片、盖玻片
4、 预冷固定液：预冷的70%乙醇或4%多聚甲醛
使用说明：
1． 细胞样品的准备：
a. 对于贴壁细胞，在六孔板或其它多孔板内或盖玻片上培养细胞至50%-80%满。
细胞培养过满会导致很难判断是否存在支原体污染。
b. 对于悬浮细胞，离心沉淀细胞，取少量细胞做细胞涂片，空气中充分晾干。
2． 用PBS按照1:10稀释Hoechst染色液(1体积Hoechst染色液加入9体积PBS)。
稀释后的Hoechst染色液宜在24小时内使用。
3． 加适量固定液固定10-20分钟。
对于六孔板的一个孔，加入1ml固定液。确保固定液充分覆盖样品，固定前切勿对细胞进行洗涤。另外对于贴壁细胞，固定前需去除培养液。
4． 去除固定液，空气中晾干。
5． 加适量10倍稀释的Hoechst染色液室温染色10-30分钟。
对于六孔板的一个孔，加入1ml染色液。确保染色液充分覆盖样品，染色时注意避光。可以用铝箔纸避光。
6． 去除染色液，空气中晾干。
7． 滴加试剂盒中提供的抗荧光淬灭封片液，封片后荧光显微镜下观察蓝色荧光。
检测效果对比图：
本试剂盒的检测效果图参考上图。左图为无支原体污染情况，中图为支原体轻度污染情况，箭头所指为微粒状的一些支原体，右图为支原体重度污染情况，可见大量微粒状的支原体。
荧光显微镜观察时需400倍或1000倍放大观察(需使用油镜)。参考上图判断支原体污染情况。没有支原体污染或其它原核生物污染的细胞样品，仅观察到细胞核的蓝色荧光，线粒体DNA不会被染色。有支原体污染的细胞样品可以观察到细胞核周围微粒状或丝状蓝色荧光。支原体污染严重的细胞可以观察到大量微粒状或丝状蓝色荧光。有细菌、酵母或霉菌污染的情况虽然Hoechst染色也会呈阳性，但细菌、酵母或霉菌污染在光学显微镜下可以观察到，而支原体观察不到，由此可以初步区分是支原体还是其它微生物。如有必要进一步鉴定，可以通过把支原体接种培养和RT-PCR等方法进行进一步检测。
原创作者：上海亨代劳生物有限公司
