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新方法在单分子水平进行电子DNA测序
DNA测序是医学和生物学关键性发现的推动力。比如，一个人基因组的全部序列为医学诊断和医疗保健提供重要的标记物和指导方针。尽管过去10年已取得众多进步，但是当前大多数高通量测序仪器都是依赖于光学技术来检测DNA的四个结构单元：A、C、G和T。为了进一步提高测量能力，科学家们已开发出电子DNA测序（electronic DNA sequencing）技术来对一组DNA模板进行测序。 *近，科学家已发现在施加的电流的作用下，DNA能够穿过蛋白纳米孔（protein nanoscale pore）从而在单分子水平上产生电子信号。然而，四个核苷酸碱基在化学结构上非常相似，利用这种技术很难将它们区别开来。因此，研究和开发一种单分子电子DNA测序平台是一个*为活跃的研究领域，而且有潜力产生一种手持的DNA测序仪：它能够破译基因组从而有助于开展个人化医学治疗和基础生物医学研究。 来自美国哥伦比亚大学的一个研究小组（由哥伦比亚大学基因组技术与生物分子工程中心主任、化学工程与药物学教授Jingyue Ju博士领导）和来自美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards ａnd Technology, NIST）的研究人员（由美国物理学会成员John Kasianowicz博士领导）开发出一种能够区分单个碱基的新方法来潜在地在单分子水平上利用纳米孔进行电子DNA测序。相关研究论文于9月21日在线刊登在Scientific Reports期刊上。 在这项研究中，研究人员报道的这种基于纳米孔的边合成边测序（nanopore-based sequencing by synthesis, Nano-SBS）的策略通过检测4种不同大小的标记而能够在单分子水平上准确地区分4种DNA碱基，其中这4种标记是从用于序列测定的5’-磷酸修饰的核苷酸（5＇-phosphate-modified nucleotide）上释放出来的。Nano-SBS策略的基本原理如下所示。在聚合酶链式反应（PCR）期间，当每个核苷酸类似物被整合进正在延长的DNA链时，由此形成的磷酸二酯键让它所携带的标记释放出来。这些标记物将按照释放的顺序进入纳米孔，并根据它们不同的化学结构产生各自独特的离子电流阻塞特征（ionic current blockade signature），因而能够利用电子手段在单分子水平上区分单个碱基并确定DNA序列。为了验证这个原理，研究人员附着4种不同长度的聚合物标记到2’-脱氧腺苷-5’-四磷酸（2＇-deoxyguanosine-5＇-tetraphosphate, 即前面所述的5’-磷酸修饰的核苷酸，是一种核苷酸类似物）的末端磷酸基团上，并证实在聚合酶链式反应期间，这些核苷酸类似物能够被有效地整入到DNA链中，而且基于它们各自独特的纳米孔离子电流阻塞特征能够更好地在单分子水平上对这四种标记进行基准线区分。这种方法与附着到以矩阵形式排布的纳米孔的聚合酶结合在一起就应当能够构建出单分子电子Nano-SBS平台。 在之前由Ju教授与Nicholas J. Turro博士领导的一项研究中， 哥伦比亚大学基因组技术与生物分子工程中心利用可裂解的荧光核甘酸可逆性末端终止（cleavable fluorescent nucleotide reversible terminator; nucleotide reversible terminator, NRT）开发出四色边合成边测序（four-color DNA sequencing by synthesis; sequencing by synthesis, SBS）平台。利用可裂解的荧光核甘酸可逆性末端终止（NRT）进行边合成边测序（SBS）是一种用于下一代DNA测序系统中的主导方法。 Kasianowicz博士和他的NIST研究团队开创性地研究了用于单分子分析的纳米孔。他们之前报道了不同长度的聚合物（即聚乙二醇, polyethylene glycol, PEG），能够通过它们在单分子水平上对α-溶血素（α-hemolysin）蛋白纳米孔中的电流读数的独特影响而被区别开来。基于此，他们随后为当前这项研究中的电子DNA测序方法给出理论上的支撑。将SBS概念与独特的纳米孔可检测的用来标记DNA结构单元的电子标签（electronic tag）结合起来就导致研究人员开发出当前这项研究中描述的单分子电子Nano-SBS方法。 正如论文作者Shiv Kumar博士指出的那样，“我们的方法新颖之处在于设计和使用4种不同标记的核苷酸，并且这些不同标记的核苷酸一旦被DNA聚合酶整入到DNA链上就会释放4种不同大小的标记，接着当这4种标记通过纳米孔时，它们就能够在单分子水平上被相互区分开来。这种方法就克服了DNA四个碱基之间的小差别所带来的任何限制，这些限制也是当前大多数纳米孔测序方法几十年来所面临的挑战。”再者，这种技术是相当灵活的；利用PEG标记作为原型，人们也能够选择其他的化学标记来在不同纳米孔系统中提供*佳的分离。 随着进一步开发这种Nano-SBS方法，如使用大型蛋白或固态纳米孔矩阵，这种系统有潜力准确地、快速地和低成本低地对整个人类基因组进行测序，从而使得它能够用于常规性医学诊断。 原文摘要： PEG-Labeled Nucleotides ａnd Nanopore Detection for Single Molecule DNA Sequencing by Synthesis We describe a novel single molecule nanopore-based sequencing by synthesis （Nano-SBS） strategy that can accurately distinguish four bases by detecting 4 different sized tags released from 5′-phosphate-modified nucleotides. The basic principle is as follows. As each nucleotide is incorporated into the growing DNA strand during the polymerase reaction, its tag is released ａnd enters a nanopore in release order. This produces a unique ionic current blockade signature due to the tag＇s distinct chemical structure, thereby determining DNA sequence electronically at single molecule level with single base resolution. As proof of principle, we attached four different length PEG-coumarin tags to the terminal phosphate of 2′-deoxyguanosine-5′-tetraphosphate. We demonstrate efficient, accurate incorporation of the nucleotide analogs during the polymerase reaction, ａnd excellent discrimination among the four tags based on nanopore ionic currents. This approach coupled with polymerase attached to the nanopores in an array format should yield a single-molecule electronic Nano-SBS platform.
