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酵母菌免疫染色的操作步骤
点击次数：990 发布时间：2012/9/19 15:51:37
（1）在细胞染色之前，制备溶于蒸馏水的lmg／m1多聚赖氨酸溶液（平均分子质量400kDa）。将多聚赖氨酸涂于载玻片上，孵育15min。用水冲洗玻片，干燥后将玻片保存在室温。
（2）建立对数生长期的酵母菌细胞。取出生长培养的样品。
（3）加入5倍体积的新鲜配制的4％多聚甲醛（见附录Ⅳ，但不溶于PBS中而用0．1mol／L磷酸钾溶解，pH6．5）。
（4）混均后于室温下孵育90min。
（5）用0．1mol／L磷酸钾（pH6．5）洗细胞3次。
（6）*后将沉淀重悬于1．2m01／L、0．12mol／L磷酸钾和33mm01／L柠檬酸（pH5．9）中。
（7）加1／10体积p—葡萄糖醛酸酶（原液来自Helix pomatia，终浓度约为10 000U／m1）和1／100体积的酵母菌裂解酶（或溶细胞酶，终浓度为50U／m1），以消化细胞壁。于30℃下孵育90min。
葡萄糖醛酸酶去除细胞壁的时间长短依赖于该酶的不同批号，在某些情况下也依赖于不同的染色方法或酵母菌的种类。
（8）用山梨醇缓冲液洗细胞3次。
（9）将细胞悬液加到涂有多聚赖氨酸的载玻片或盖玻片上，于室温下孵育15min。
（10）将玻片浸入甲醇中， —20℃6min。
（11）将玻片转置丙酮中， —20℃30s。
（12）在含1％BSA的PBS中漂洗玻片5min。
（13）在含1％羊IgG的PBS中孵育玻片1h。
在此方法中，来自非免疫动物的羊IgG用作封闭剂。可以从正常羊血清中通过蛋白G纯化而获得。该封闭试剂是有选择的，因本文推荐的标记二级试剂是羊抗鼠（或兔）免疫球蛋白抗体。如果使用的是其他来源的标记二级试剂，应改变封闭剂，如可选用3％牛血清白蛋白。
（14）用PBS洗玻片一次。
（15）将盖玻片、载玻片或平皿放置在乎面上。
（16）加足量的一抗覆盖所需的面积。通常体积
单克隆抗体通常从杂交瘤细胞培养上清中获得（特异性抗体浓度为20—50vg／m1）。小鼠腹水、纯化的单克隆和多克隆抗体以及粗制的多克隆抗血清应该测试其稀释度。如果特异性抗体的浓度是未知的，制备并测试初始制品的不同稀释度（1：10，1：100，1：1 000，1：10 000）。
（17）将盖玻片、载玻片或平皿在室温下至少孵育30min。若孵育的时间<1h，则不需要保持湿度，可将玻片放置在桌面上。对于某些抗原抗体反应，孵育时间延长达12h可增加反应的灵敏度。但一定不能让样品干燥，简单的办法是放一片封口膜在样品上。较长时间的反应应降低抗体的浓度。
（18）用PBS洗3次，每次5min以上。
PBS缓冲液中可以含1％TritonX-100或NP-40，以帮助解决背景问题。
（19）加入荧光素标记的抗Ig抗体。这些试剂可从商品试剂公司购置。应确认所选择的第二抗体对于一抗是特异性的。例如，如果抗体是由兔所产生的，则应选择羊抗兔Ig。第二抗体应该用含蛋白质的溶液如1％羊IgG进行稀释。试剂提供者可建议适合的稀释度，但如果没有提供有关信息，可进行二抗稀释度测定，稀释度范围在1：10和1：1000之间。
（20）加入标记的二抗试剂后在室温下孵育至少20rain，但不应超过1h。
（21）用PBS洗3次，每次5min以上。
（22）用Gelvatol或Mowiol封片。在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察并照相。
原创作者：上海金穗生物科技有限公司
