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冷冻组织切片
点击次数：406 发布时间：2012/10/8 9:51:30
1．主要内容
如果定位检测范围为每个细胞约1000～10 000个抗原分子。
检测抗原存在及定位；
定性及半定量；
敏感度依赖于抗原的水平及存在部位；
如果抗原局部浓度较高，则使用亲和力较低的抗体。
2．操作步骤
（1）将未受损伤的组织切剖成小样本，约lcmXIcmX0．4cm。
（2）将标本放在卡片的一端。标记该卡片，将带有标本的一端浸入液氮中。60s后，取出标本并放在干冰上。修剪卡片，使其大小刚好比组织块稍大些，转入预冷的（—70℃）带有标记的小瓶中。
（3）切片前，用1％明胶包被洁净的载玻片。加热至50C使明胶溶于水中，冷却，加入0．02％叠氮钠。将玻片浸入明胶溶液中30s，取出， 自然干燥。
（4）按照仪器使用说明书，用低温恒温器制备冷冻切片。通常切片厚度在5—10gm之间。用包被过的载玻片收集切片。
（5）让切片自然干燥。浸入新鲜配制的4％多聚甲醛中2min。
（6）用PBS洗数次，放入含1％NP—40的PBS中5rain。用PBS洗数次。
（7）将带有组织切片的载玻片放在湿盒中。加合适稀释度的一抗，用含蛋白质的溶液如3％BSA／PBS稀释抗体。
单克隆抗体选用杂交瘤细胞培养上清（特异性抗体浓度为20—50gg／m1）。小鼠腹水、纯化的单克隆抗体和多克隆抗体，以及粗制的多克隆抗血清应该测试其稀释度，以使特异性抗体的浓度在0．1～10t~g／m1之间。如果特异性抗体的浓度是未知的，则制备并测试初始制品的不同稀释度（1：10，1：100，1：1000和1：10 000）。
（8）将玻片置湿盒中于室温下孵育至少60min。对于某些反应来说，孵育时间可延长至24h，以增加其敏感性。
（9）用PBS洗3次，每次5min以上。
（10）加辣根过氧化物酶标记的二抗（特异性针对一抗）。这些试剂可以购自不同的经销商。如果二抗的确切用量是未知的，测试1：50—1：1000稀释的二抗。用含蛋白质的PBS稀释，如3％BSA／PBS。
（11）将样本置湿盒中，于室温下孵育30min。
（12）用PBS洗3次，每次5min以上。
（13）配制DAB／金属盐试剂。将6mg DAB溶于9ml 0．05mol／L Tris缓冲液（pH7．6）中。加lm[0．3％（W／V）氯化镍贮存液（可用相同浓度的氯化钴代替）。加0．1ml 3％过氧化氢。如果出现沉淀，用Whatman 1＃ 滤纸（或相似品）过滤。
（14）将上述溶液加到标本中。在低倍光学显微镜下观察。当形成足够的棕／黑色沉淀时，用水冲洗以终止反应。通常这一反应过程约需1—20mino
（15）加数滴Harris苏木精。孵育约5min。时间长短取决于染色的强度。
（16）用水轻柔冲洗。
（17）通过各级乙醇使标本依次脱水。在75％乙醇中孵育两次，每次3min，95％乙醇中2次，每次3rain，100％乙醇中2次，每次3min。自然干燥。
（18）加一小滴DPX至标本上。小心在其上面放一盖玻片（1＃） 避免产生气泡。用纸巾去除多余的液体。
DPX很快可以凝固，样品便可观察并照相。
原创作者：上海金穗生物科技有限公司
