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免疫复合物的纯化的常见问题
点击次数：453 发布时间：2012/10/10 9:31:28
*常遇到的问题可能是采用什么方法来减少免疫沉淀时混杂在免疫复合物中的无关蛋白。本底的产生有多方面的原因，可以是特异性的或非特异性的。在抗体制品中存在的无关抗体可以直接与抗原发生交叉反应而产生特异性背景条带。解决这个问题只有两种方法。首先，通过抗原亲和层析柱对抗原特异性抗体进行纯化可除去污染的抗体；其次，加入饱和量的冷蛋白与污染抗体结合而封闭其活性。
非特异本底蛋白有多种来源。它们可以和免疫复合物或蛋白A／G微球形成非共价结合的条带，或与制剂中的特殊物质结合。某些污染蛋白凝聚或聚合成较大的分子可通过离心除去。有些蛋白质可被抗原—抗体蛋白A／G复合物的晶格结构网获。污染的蛋白亦可与用于离心免疫复合物的塑料管结合。
推荐使用以下方法解决非特异本底问题：
①加入饱和量的竞争蛋白·。常用的有BSA，明胶，丙酮脏器干粉或5％的脱脂奶粉。将SAC或蛋白A微球储存在含有2％BSA的缓冲液中。
②在加入抗体之前100 000g，30min离心裂解产物，除去凝聚的蛋白质。
③试用不同的抗体。
④将抗体在100 000g离心30rain，重新滴定。
⑤使用较强烈的洗液，可试用1．0mol／L氯化钠、0．5mol／L氯化锂、1mol／L硫氰酸钾、0．2％SDS或1％Tween20。改用浓度由高到低的缓冲洗涤液或不同的去污剂也有帮助，亦可试用蒸馏水洗1次。
⑥增加清洗次数，每次清洗时使固相载体在洗液内留置10min。
⑦若检测放射活性，将cpm值减少到抗原检测所需的限度。
⑧在使用之前，裂解物不可冷冻。
⑨如果特异性的蛋白仍然存在，则待检蛋白可能包含多条多肽链。
使用特殊的抗体或当抗原溶液的体积特别大时，免疫复合物不可能有效地与蛋白A或蛋白G微球结合， 当出现这些情况时，在免疫沉淀中途加入抗免疫球蛋白的抗体（抗抗体）可能有帮助。重要的一点是滴定出能结合所有一抗的二抗的量。不同批号的抗血清所需的量不同。
原创作者：上海金穗生物科技有限公司
