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免疫复合物的纯化的基本操作
点击次数：428 发布时间：2012/10/10 9:31:59
1．准备工作
蛋白A或蛋白G微珠混悬液可在用前准备，4℃保存于含叠氮钠的溶液中。
2．所需溶液和特殊设备
裂解缓冲液、抗体、蛋白A或蛋白G微球（用含0．02％叠氮钠裂解缓冲液配成10％（V／V）的混悬液，4℃保存）、不含DTT的Laemmli样品缓冲液（2％SDS、10％甘油、60mm01／LTris，pH6．8和0．02％溴酚蓝）、1m01／LDTT（保存于—20℃）
摇床、抽吸装置（大多是通过导管与负压瓶一室内真空器连接）。
3．操作步骤
（1）将小量裂解物样本分别置于适当数量的1．5mlEP管中，加入裂解缓冲液，至终体积接近0．5 m1。加入抗血清（1ul）、杂交瘤细胞培养上清液（50ul）或小鼠腹水（0．5ul）作为抗体的起始用量。滴定时抗血清用0．5—5ul，杂交瘤细胞培养上清液用10～100ul，腹水用0．1～1．0ul。
（2）冰上孵育1h。高亲和力的结合反应在1h内完成。因而，1h的孵育时间可使大部分的抗体完成反应。
（3）在抗体—抗原反应液中加入100ul蛋白A或蛋白G微球（用裂解缓冲液配制成10％混悬液），4℃摇动孵育1h。
尽管有些操作手册建议反应过夜，但实际上并无好处，还会增加背景，因此不主张反应过夜，除某些特殊情况外。
在每一步操作的*后，尽可能完全去除洗涤缓冲液，有利于降低背景。建议在真空泵吸气管末端使用23号针，或用微量加样枪头以减慢流速，控制微球，如果枪头很小可直接插入微球中去除洗涤缓冲液。若微球黏附针孔，在管壁上轻弹即可去除。
振摇小管
（4）以10000g，4℃离心15s，收集微球。用裂解缓冲液清洗免疫复合物3次。裂解产物和洗涤缓冲液很容易通过抽吸法除去。
免疫复合物的吸取
（5）尽可能完全吸去*后一次的洗涤液，将免疫复合物用于相应的实验。
用于SDS-PAGE时， 加入50t~l Laemmli样品缓冲液（2％SDS、10％甘油、100mmol／LDTT、60mmol／LTris，pH6．8和0．01％溴酚蓝），加热至8512 10min，离心，吸取上清液，将其作为样品加入凝胶内进行电泳（见后）。若暂不进行凝胶电泳，可将样本置于—2012保存。
原创作者：上海金穗生物科技有限公司
