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胶体金标记蛋白质的纯化
标记好的免疫金探针必须经过纯化处理才能用于IHC染色，尤其是免疫电镜的染色。纯化的目的就是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金及在标记过程可能形成的各种聚合物。其纯化方法有超速离心法、色谱柱法以及以上二者相结合应用。
（一）超迷离心法
根据胶体金颗粒大小不同及蛋白质种类不同，离心的转速和时间也不同。用牛血清白蛋白稳定的胶体金标记羊抗兔IgG，可先从低速离心（20nm颗粒用250g；5nm用4800g20min），弃去聚集的金颗粒所形成的沉淀，然后将上清液5nm金标记物用60000g于4℃离心1h，20nm和40nm金标记物用14000g于4℃离心1h。小心地吸出上清，将管底沉淀再用1％牛血清白蛋白缓冲液混悬至原量，平衡过夜后，重复离心2次，*后一次洗涤离心的沉淀，再用1％牛血清白蛋白缓冲液（含0．02mol/LNaN3）稀释到l：20。40nm金颗粒在520nm检验吸光度为0．35；20nm金颗粒为0．30；5nm金颗粒为0．25，用1％牛血清白蛋白缓冲液作空白。制备的胶体金—蛋白探针可保存于4℃，如加入50％甘油可贮于0℃以下（-18℃）1年以上。
以聚乙二醇稳定的葡萄球菌A蛋白标记胶体金，按胶体金制备方法及所得颗粒大小不同，用不同离心转速分离纯化，以白磷还原法制备的5．0nm胶体金A蛋白，用125000×g离心；抗坏血酸法制备的11．3nm胶体金—A蛋白，用150000g离心45min，可见离心管底部附贴有小片紧密的沉淀，其上为较疏松的红色沉积物，再上为透明的上清液。附贴管底的沉淀无用，以后操作步骤中不要搅起来，仍保持其贴于管底。弃去上清液后，用等体积的0．0lmol/LPBS（pH7．2）溶解疏松红色沉积物，同上重复离心1次，小心移去上清液，剩余0．5ml上清液，将疏松红色沉积物溶解后，即为初步提纯的金标—A蛋白试剂。
（二）凝胶过滤法
凝胶过滤法必须以BSA为稳定剂。将前述胶体金—蛋白质复合物装入透析袋内，置硅胶中浓缩至原体积1/10左右，用蒸馏水冲洗软化透析袋后，取出浓缩液，以15000r/min离心15min（或用上述离心法纯化后的胶体金，再进一步用此方法纯化）。吸取上清液加到丙烯葡聚糖S-400（SephacrylS-400，Pharmacia公司产品，Sweden）色谱柱上分离纯化。柱床高20cm，直径0．8cm，加样体积为柱床体积的1/10。用0．02mol/LTBS液（内含0．1％BSA，0．05mol/LNaN3，pH8．2者用于胶体金标记IgG，pH7．0者用于胶体金标记蛋白A）洗脱，流速为8ml/h，按红色深浅分管收集洗脱液。可见先滤出的液体呈微黄色，有时略浊，内含大颗粒聚合物等杂质。纯化的金标记蛋白滤出液随浓度增加而红色逐渐加深，清亮透明，此后为略呈黄色的未标记蛋白组分。表中列出胶体金与蛋白质结合后，用离心法纯化的条件。表6—8列出几种免疫金探针离心纯化的条件，仅供参考。
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