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用PCR识别不同的噬菌体抗体克隆
[方法]
1.配制PCR“主混合液”,每克隆20ul PCR混合液, 包含:
● 水,15.5ul
● 10XRT缓冲液,2.0ul
● 5mmol/L dNTP, 1.0ul
● 5,引物,1.0ul
● 3,引物,1.0ul
● Taq聚合酶,0.2ul
如果PCR缓冲液中不含Mg2+,这应加至终浓度为1.5mmol/L。也可以使用与DNA聚合酶配套供应的PCR试剂。
2.取20fLl主混合液加到0.5m1管内,或加入96孔PCR微孔板孔内。
3.用l根牙签轻轻接触单个克隆并在PCR反应液中转动,注意不要转移太多材料。如在PCR反应液中有过量细菌,会抑制PCR反应。扔掉牙签;或如有需要,用它在1个单独的96孔培养孔板内培养基救援该克隆;或者在琼脂平板上接触表面。用1~2ul甘油储存料或主板培养液,也可以代替相应克隆。
4.反应液上铺上矿物油。
5.用PCR仪格内加热试管或孔板至94℃,10分钟。裂解细菌使其释放模板DNA。然后,以94℃1分钟、55~60℃1分钟(对于Fab片段文库的筛选则为2分钟)、72℃ 1分钟的条件孵育,共循环30次。
6.建议在PCR后取5ul PCR反应产物在2%琼脂糖胶上检测。这将显示有多少克隆包含全长的插入序列。
7.PCR后,在矿物油下面加入20ul主混合液,成分如下:
● 乙酰化BSA(10mg/ml), 0.2ul
● BstNⅠ缓冲液(10×),4.0ul
● 水,15.3ul
● BstNⅠ (10U/ul),0.54ul
8.60℃孵育样本2~3小时。
9.将2ul样本染液与8ul反应混合物(取自矿物油下面)混合并在4%Nusieve琼脂糖胶上电泳;此胶用含0.05ug/ml溴化乙锭的0.5倍TBE缓冲液配制。或者是用2.5%琼脂糖胶电泳(此胶的分辨率较低)。
10.以100V(10V/cm)跑胶并在UV transillu minator上比较各种不同的单独克隆的带型。