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从cDNA第一链中扩增VH和VL基因
点击次数：438 发布时间：2013/3/9
[器材和试剂]
● Vent DNA聚合酶和10 X缓冲液
● 20 × dNTP （每种浓度5mmol/L）
● V区特异性正向（3’）（JHFOR、JKFOR及JLFOR）和反向（5，）（VnBACK、VKFOR及VAFOR）PCR引物
● PCR热循环仪
● 矿物油（Sigma）
● Geneclean试剂盒（Qbiogene，Inc．）
● cDNA链
[方法]
1．在0．5ml微量离心管中配制50ul PCR反应混合液， 包括：
● Millipore水， 31.5ul
● 10×VentDNA聚合酶缓冲液，5．0ul
● 20×dNTP， 2．5ul
● 正向引物，2．0ul
● 反向引物，2．0ul
● 来自实验方案13．2的cDNA反应混合液，5．0ul
2．在热循环仪格内加热反应体系到94℃5分钟。如果没有加热盖，则滴加1滴轻质矿物油覆盖反应液。
3．加入2．0ul（2单位）VentDNA聚合酶。
4．以94℃1分钟、60℃1分钟、?2℃1分钟的条件共循环30次，扩增V基因。
5．用0．5％琼脂糖凝胶电泳纯化PCR片段；按照厂家说明书， 用Geneclean试剂盒从胶中提取目的组分。将每种产物重悬于20ul水中。在1％琼脂糖凝胶中，与已知大小和浓度的标准对照品比较，测定目的DNA浓度。
