企业档案
- 会员类型：免费会员
- 工商认证： 【已认证】
- 最后认证时间：
- 法人：
- 注册号：****
- 企业类型：生产商
- 注册资金：人民币万
联系我们
联系人：崔利军
热门标签
公司动态
Topl0F’细胞中的电转化及文库储存
点击次数：350 发布时间：2013/3/12
[方法]
1．加2～3ul纯化的连接反应物（值为0.3ug DNA）到80ul的Top10F’电转化感受态细胞中，轻轻摇晃混合。使用30ng（2ul）的pUCl9控制电转化效率。
2．将细胞+DNA悬浮液转移到已冷却的0．2 cm细胞电转化管，并冰浴3分钟。
3，将Gene Pulser Plus电穿孔仪设置为2．5kV脉冲，电容器设为25uF，脉冲控制器设为200ns。
4．用纸巾干燥电转化管，然后将它放在电转化箱中，使用一个脉冲（寄存时间常量必须为4．5～5．0毫秒）。
5．立即加lmlLB到电击管中，打散细胞，然后将细胞悬浮液转移到15ml聚丙烯试管中。
6．在37℃下振荡，使细胞能够表达抗抗生素的标记。
7．组合所有的电转化样品，通过100ul适当稀释后均匀地倒在小LBAT平板上来确定文库的大小，用pUCl9控制电转化能产生大约3×107的转化产物。
8．在20℃，2500g下旋转组合电转化样品15分钟，在0．5XLBAT起始体积中打散沉淀颗粒，将1 ml细胞悬浮液涂抹在每一平方LBAT平板上。
9．在37℃过夜孵育该板。
10．在每个平方板上洒上10ml LBAT以获得文库，，用无菌延辗机敲碎细胞，将已打散的细胞转移到50ml聚丙烯试管中。
11．重复实验方案12．10，用5m1 LBAT除去板上留下的细胞。
12．在600nm测量细胞悬浮液的光密度（OD），如果有必要，可以将浓缩的细胞系稀释到每毫升LBAT 40 OD600nm单位。
13．制备甘油菌，将5ml的甘油加到5ml的浓缩细胞系中，混合后均等地分到1m1聚丙烯冷冻管中，在-70℃冷冻及储存，*后细胞浓度将是每毫升20 OD600nm位，这大约是每毫升1．6×1010个细胞。
