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噬菌体展示文库T7体外筛选的特殊步骤
点击次数：967 发布时间：2013/3/14
1．为了洗脱细菌，将BL21或BLT5615过夜培养的菌液用M9LB稀释到在600nm处的 OD值为1。如果使用BLT5615菌株与T7Selectl—1或T7Selectl0—3载体，就必须向菌 液中加入IPTG，使其终浓度为10umol/L。将细胞沉淀重悬于lml该菌液中，并在室 温下孵育10分钟。也可以选择通过向每份沉淀中添加100~tl的1％NP—40来裂解细胞，并在加入900txl的BL21或BLT5615菌液之前，将细胞置于冰上裂解5分钟，然后在室温下孵育10分钟。由于噬菌体结合在4℃进行，所以裂解作为可选步骤。
2．为了测定噬菌体的产出量，从步骤1的试管中分别取1ul 1：10稀释液、1ul原液和10ul原液铺板，每种铺3个：分别取1ul 1；10稀释液、1ul原液和10ul原液加入14mlFalcon管中，同时还加入300ul在600nm处OD值为1的BL21或BLT5615（含IPTG）菌液，并与4ml熔化的（45—50℃）上层琼脂混合。将含有噬菌体和细菌的上层琼脂倒于LB琼脂（BL21）平板上，或是倒在含50gg/ml羧苄青霉素的LB琼脂 （BLT5615）平板上。将平板置于37℃孵育1．5～3小时，或室温下孵育过夜。
3．为了测定每份器官或组织的噬茵体总产出量，将每个平板上的噬茵斑（pfu）数目除以铺板体积（0．1ul、lul或10ul），然后再乘以1000ul。这样计算的原因是每份细胞沉淀中添加了1000ul细菌培养物。对每份器官和组织中的三种平板进行平均计数，并作图。
4．扩增及纯化回收的T7噬菌体。
