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用于噬菌体cDNA文库展示的载体
1 丝状噬菌体
因为全长cDNA包括在3’末端的翻译终止子,原核表达时缺乏合适的核糖体结合位点(如果这些cDNA来源于真核细胞),确保cDNA在噬菌体表达的*实际的方法是将5’末端与载体基因融合。传统上,噬菌体展示是与衣壳蛋白pⅢ或pⅧ的N末端融合,并且普遍认为直接与任一个衣壳蛋白的C末端融合都与噬菌体装配不相容。因此,围绕这些限制条件设计了三个专门的载体:一个策略是把pⅢ与c-Jun的亮氨酸拉链融合,而翻译的cDNA产物与c-Fos(pJufo)的亮氨酸拉链的C末端融合。噬菌体装配时,拉链结合在噬菌体的末梢,因此壳体包裹的eDNA与它编码的产物相连。第二个策略是直接相互获取法(Direct Interaction Rescue),利用小衣壳蛋白pⅢ的功能模块性:eDNA通过与pⅢ的感染性结构域的C末端融合来表达,而蛋白探针放在pⅢ的C末端部分,包埋在噬菌体的核心。只有那些能在探针和特异的eDNA编码产物之间建立稳定相互作用的噬菌体才能恢复它们的感染性,同时用来在大肠杆菌中扩增。第三个策略(在本章将详细描述)是围绕pⅢ并基于一个结论,这个结论是小衣壳蛋白pⅥ的C末端表达在表面,因此一个富含甘氨酸的六肽基因Ⅵ(gⅥ)-cDNA的融合基因可以在噬菌体表面显示。蛋白Ⅵ(pⅥ)通过在pⅢ和噬菌体核心之间提供链接来稳定噬菌体的结构。这三个系统在蛋白配体和(或)多克隆抗血清选择文库中的eDNA克隆相互作用上被证明是成功的。*近一团体出人意料地报道了通过优化联接序列(8~10个氨基酸)与pⅢ或pⅧ的C末端融合,多肽能在丝状噬菌体表面被功能性地展示出来。理论上,这个惊人的功能融合应该在eDNA克隆基因表达上起着很重要的作用,但是理论上的证据仍然需要证明。
2 溶解性噬菌体(lytic bacteriophage)
在丝状噬菌体系统中,衣壳蛋白先组合成噬菌体颗粒,然后定位在外周胞质上。然而这种途径适应于有二硫键形成的蛋白(例如分泌蛋白或受体的细胞外结构域),但它与在还原环境下能正常折叠的eDNA编码产物不相容。事实上,大多数噬菌体颗粒内部结构相似,如入噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体,它们都用来展示编码细胞内部蛋白的cDNA。在入噬菌体中,已经报道了与衣壳蛋白DEl5]或尾部蛋白VD6]的C末端融合。衣壳蛋白D用来显示和选择cDN段,这些片段来源于丙型肝炎病毒基因组、人脑以及小鼠的胚胎。在T4噬菌体中,衣壳蛋白WAC和SOC的C末端作为蛋白的靶点,用于共价展示,而T7噬菌体展示系统依赖于衣壳蛋白10A的C末端的溶解性。近年来,在多个报道中都证明了以eDNA选择为目的的系统具有可用性。利用这个具有前景的方法制备一个克隆试剂盒在商业上是可行的(Novagen)。