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鉴别DNA甲基化，总有一款工具适合你
摘要：
一谈到真核遗传，众所周知基因组仅仅是个起点，目前表观基因组的研究正是炙手可热。自2009年以来，表观遗传学修饰已使遗传字母表扩充到了八个成员A、C、G、T、5-mC、5-hmC、5-fC和5-caC。除了标准甲基化形式5-mC，其他甲基化类型也逐渐成为研究热点。这几种甲基化修饰就像亲兄弟，要准确分辨它们可并不容易，本文就为您初步总结了几种甲基化识别方法和工具。
一谈到真核遗传，众所周知基因组仅仅是个起点，此外还有表观基因组，这种可遗传的DNA和组蛋白化学修饰控制着基因组的表达。
5-mC和5-hmcDNA甲基化就是这类化学修饰中的一员，甲基化一般发生在哺乳动物基因组CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基（5-甲基胞嘧啶/5-mC），主要集中于CpG岛和基因调控元件，与基因沉默有关。
其实人们早在几十年前就发现了DNA甲基化现象，5-甲基胞嘧啶还被称为DNA的“第五种碱基”，表观遗传学研究者们开发了大量的分子工具来追踪和分析它。然而在2009年，两组研究团队（洛克菲勒大学Nathaniel Heintz团队和哈佛医学院Anjana Rao团队）同时在Nature杂志上发表了重要文章，他们发现了另一种甲基化修饰形式——5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），这无异于在生物学界投下一枚重磅炸弹。生物通 www.ebiotrade.com
“自2009年以来的变化可能就是，现在大家的研究主要集中在这些DNA甲基化变体上，”Active Motif公司产品经理Kyle Hondorp说，Active Motif公司是一家以“促进表观遗传学研究”为宗旨的美国知名公司。
在上述两篇文章中，研究人员分别在小鼠Purkinje神经元和胚胎干细胞中发现了5-hmC，5-hmC与5-mC在细胞和基因组中的分布不同，5-hmC主要集中在基因片段中。TET蛋白家族的酶对5-mC进行修饰形成了5-hmC。然而，许多传统DNA甲基化研究方法都无法分辨这两种类型的修饰，默克密理博的表观遗传学产品经理Michael Sturges说，这意味着人们需要重新审视过去几十年的一些甲基化分析。
“这说明在过去15至20年间，人们收集到的数据在一定程度上包括了羟甲基胞嘧啶事件，”Sturges的同事，默克密理博的表观遗传学研发经理John Rosenfeld说。
5-fC和5-caC不过，遗传学字母表中可不止这六个成员，除了A、C、G、T、5-mC和5-hmC，至少还存在两种甲基化修饰类型。DNA甲基转移酶负责对真核生物的胞嘧啶残基进行甲基化。Tet1能够将5-mC转化为5-hmC，但这种酶并未就此罢手，它能够进一步将5-hmC氧化成为5-甲酰胞嘧啶（5-fC），甚至再转化成为5-羧基胞嘧啶 （5-caC），这一酶促通路似乎参与了去除DNA 5-mC标志的过程，Rosenfeld说。（该通路的更多信息，请参阅Active Motif的DNA甲基化指引手册。）研究以上各种甲基化类型的方法就是亲和捕获。标准5-甲基胞嘧啶的传统研究方法是甲基化DNA免疫沉淀MeDIP和MIRA（methylated CpG island recovery assay），这两种方法分别利用抗5-mC的抗体和甲基化DNA结合蛋白 （MBD）来捕获被修饰的DN段。而现在，研究人员也同样能够使用特异性抗体对5-hmC进行研究。
目前包括默克密理博在内的许多公司都提供抗5-hmC的抗体，Active Motif当然也不例外。Active Motif将这种抗体打包在hMeDIP（羟甲基化DNA免疫沉淀）试剂盒中，用来捕获包含甲基化修饰的DNA序列。除此以外，研究者们还可以使用该公司新品Hydroxymethyl Collector™试剂盒来富集含5-hmC的DN段。（Active Motif也为那些对5-fC或者5-caC的研究者们提供了相应抗体。）
“Hydroxymethyl Collector是我们去年发布的*引人注目的技术，”Hondorp说。
Active Motif公司的MethylCollector Ultra™ 试剂盒是利用MBD2b和MBD3L1来纯化甲基化的DNA。而Hydroxymethyl Collector试剂盒则不同，它利用了一种酶——beta-葡萄糖基转移酶（Millipore也有相应产品提供），这种酶能够特异性的使5-hmC糖基化。这种被转移的葡萄糖基是经历过叠氮化合物修饰的，它能与生物素相连，使得Hydroxymethyl Collector试剂盒中的链霉亲和素磁珠能够捕获含5-hmC的DN段。
使用hMeDIP和Hydroxymethyl Collector试剂盒得到的都是是DN段的混合物，其中每条片段中都至少含有一个5-hmC修饰。研究人员可以对这一混合物进行测序来得到整个基因组的羟甲基化信息，或者也可以通过PCR进行逐个位点的分析。当然这种混合产物还可以用于芯片分析。专门针对甲基化研究的芯片包括：美国安捷伦科技公司的DNA Methylation Human CpG Island芯片和Illumina公司的Infinium® HumanMethylation450 BeadChip等。罗氏NimbleGen也有一款包括10个芯片的Human DNA Methylation 2.1M Whole-Genome Tiling芯片组合，不过据罗氏应用科学公司的市场部经理Clotilde Teiling称，由于NimbleGen准备将重心从芯片领域转到序列捕获产品，该芯片产品将于今年年底停产。
New England Biolab公司的EpiMark® 5-hmC ａnd 5-mC analysis 试剂盒也是同样利用beta-葡萄糖基转移酶对5-hmC进行糖基化。不过，这一试剂盒是根据糖基化后5-hmC和5-mC对限制性内切酶的敏感性不同来进行区分，未糖基化的甲基化位点含有对MspI（5＇-C / CGG-3＇）敏感的序列，而糖基化的序列则对MspI酶不敏感。
此外还有一种特异性识别5-hmC的酶，限制性内切酶PvuRts1I，这种酶Active Motif也有提供。PvuRts1I与含5-hmC的DNA结合，在相应核苷酸位点（9和13）对双链进行切割，得到含5-hmC的24bp片段。用这种酶处理基因组DNA就会得到上述片段的混合物，对这种片段混合物进行测序的效果与MeDIP测序相同，都能够揭示基因组范围的5-hmC位点。
原创作者：北京冬歌生物科技有限公司
