甲磺酸乙酯（EMS）细胞突变诱导试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

甲磺酸乙酯（EMS）细胞突变诱导试剂是种旨在使用烷化剂甲磺酸乙酯诱导细胞发生变异而产生HPRT或TK基因功能缺失的突变株，成为筛选应用标记细胞的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于动物细胞和人体细胞。产品严格无菌，即到即用，性能稳定，突变频率高。

技术背景

甲磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate，EMS）是种化学诱变致畸的烷化剂（alkylating agent）。它将导致细胞次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase；HPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine kinase，TK）基因座发生位点突变，而引起基因功能缺失。由此采用6-硫氢基鸟粪嘌呤（6-thioguanine；6-TG）和5-溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine；BudR）分别筛选TK和HPRT缺失型细胞，因为6-TG是PURINES的结构替代物，而BUdR是THYMIDINE的结构类似物，当TK和HPRT正常的情况下，它们将利用6-TG和BUdR进行DNA复制而使细胞死亡，反之，它们无法利用，细胞则继续生存。这是负向选择。但是HPRT正常的细胞（例如正常人体细胞，其X染色体的长臂上带有此基因）能在氨基嘌呤胸苷（hypoxanthine/aminopterin/thymidine；HAT）培养基中生长，这是正向选择。

产品内容

 EMS 溶液A（Reagent A）       5毫升

 EMS 溶液B（Reagent B）    5毫升

 EMS 溶液C（Reagent C）    5毫升

 EMS 溶液D（Reagent D）    5毫升

 EMS 溶液E（Reagent E）    5毫升

清理液（Reagent F）     2 X 500毫升

染色液（Reagent G）       200毫升

 TK筛选液（Reagent H）   12毫升

产品说明书              1份

保存方式

 TK筛选液（Reagent H）保存在－20℃冰箱里；清理液（Reagent F）和 EMS溶液保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent G）保存在室温下； EMS溶液具有毒性，注意操作安全。有效保证6月

用户自备

25cm²细胞培养瓶：用于培养细胞的容器

75cm²细胞培养瓶：用于培养细胞的容器

 DMEM完全细胞培养基（12052）：用于细胞培养的营养基

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于细胞脱离

血细胞计数器：用于细胞计量

封口膜：用于密封培养瓶后长期保存

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

台式离心机：用于样品离心操作

 1摩尔硫代硫酸钠（12043）：用于EMS解毒

实验步骤

．确定甲磺酸乙酯（EMS）的毒力曲线

1． 准备5瓶25cm²细胞培养瓶，并标记为1至5号试验瓶

2． 接种用户需化学诱变的细胞

3． 放进37℃细胞培养箱孵育，直到细胞生长密度达50％

4． 抽去细胞培养液

5． 分别加入5毫升用户自备的完全细胞培养液

6． 依次加入50微升 EMS溶液A至E（Reagent A至E）到相对应的培养瓶1至5号（ EMS溶液A即1号为对照组）

7． 轻轻摇匀后，放进37℃细胞培养箱孵育24小时

8． 抽去培养液，分别加入5毫升用户自备的完全细胞培养液（不含 EMS溶液）

9． 放进37℃细胞培养箱孵育24小时

10． 抽去培养瓶里的培养液

11． 分别加入3毫升清理液（Reagent F），清洗生长中的细胞表面

12． 分别抽掉3毫升清洗液

13． 分别加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面

14． 置入37℃培养箱孵育2分种

15． 轻轻抖动培养瓶，使细胞脱落

16． 分别加入5毫升用户自备的完全细胞培养液

17． 分别移入15毫升锥形离心管

18． 在血细胞计数器上计数

19． 分别移取总量为1000个细胞到5个新的25cm²细胞培养瓶，并作好对应标记

20． 加入用户自备的完全细胞培养液至总量为5毫升

21． 放进细胞培养箱孵育，直至肉眼清晰可见细胞群落（1周左右）

22． 小心抽去培养瓶里的培养液

23． 轻轻分别加入3毫升清理液（Reagent F）到每个培养瓶里，清洗生长表面

24． 小心抽去每个培养瓶里的清理液

25． 分别加入2毫升的染色液（Reagent G）到每个培养瓶里，覆盖生长表面

26． 在室温下静置20分钟

27． 抽去染色液（Reagent G）

28． 分别加入3毫升清理液（Reagent F），清洗细胞表面

29． 分别抽掉清理液（Reagent F）

30． 肉眼观察并计数细胞群落

31． 绘制细胞群落数和EMS浓度曲线

32． 确定细胞群落数是对照组（1号培养瓶）的30％为佳EMS诱导浓度

33． 用封口膜密封培养瓶，可在室温下长时间保存

二．实施甲磺酸乙酯（EMS）的细胞诱变

1． 准备1瓶75cm²细胞培养瓶

2． 接种用户需化学诱变的细胞

3． 放进37℃细胞培养箱孵育，直到细胞生长密度达50％

4． 抽去细胞培养液

5． 加入20毫升用户自备的完全细胞培养液

6． 加入200微升诱导浓度的 EMS溶液（实验确定的A至E中的种）到培养瓶（1：100）

7． 轻轻摇匀后，放进37℃细胞培养箱孵育24小时

8． 抽去培养液

9． 分别加入20毫升用户自备的完全细胞培养液（不含 EMS溶液）

10． 放进细胞培养箱孵育24小时

11． 抽去培养瓶里的培养液

12． 加入5毫升清理液（Reagent F），清洗生长中的细胞表面

13． 抽去5毫升清理液（Reagent F）

14． 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面

15． 置入37℃培养箱孵育3分种

16． 轻轻抖动培养瓶，使细胞脱落

17． 分别加入6毫升用户自备的完全细胞培养液

18． 移入到15毫升锥形离心管

19． 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g

20． 小心抽去上清液

21． 加入9毫升用户自备的完全细胞培养液，充分混匀

22． 平均移取3毫升到3瓶75cm²细胞培养瓶

23． 每瓶分别加入17毫升用户自备的完全细胞培养液到培养瓶里，总量为20毫升

24． 每瓶分别加入200微升 TK筛选液（Reagent H），轻轻混匀

25． 放进细胞培养箱里孵育2至3周

26． 获得突变细胞株（TK^-）