YIJI细菌碱性磷酸酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途

YIJI细菌碱性磷酸酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物对硝基苯磷酸受到碱性磷酸酶的水解，产生有色产物，在分光光度仪下，其吸光峰值的变化，即采用比色法定量测定细菌样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细菌菌株（野生或培养）裂解样品碱性磷酸酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作简捷，性能稳定。

技术背景

碱性磷酸酶（Alkaline Phophatase；ALP；EC3.1.3.1）存在于许多细菌细胞中的外周膜结合性酶，为同源二聚体金属性酶蛋白。一旦细菌的磷浓度过低，则诱导碱性磷酸酶的活性，其功能在于参与细菌磷代谢。在分子生物学和免疫学实验和诊断运用中，碱性磷酸酶成为一种重要的工具。碱性磷酸酶在碱性条件下水解单磷酸。基于底物对硝基苯磷酸（p-nitrophenyl phosphate；PNPP），在碱性磷酸酶的催化水解下，释放出对硝基苯酚（p-nitrophenol）和磷酸（phosphate），通过分光光度仪检测对硝基苯酚（410nm），来定量测定碱性磷酸酶的活性。碱性磷酸酶反应系统为：

Alkaline Phophatase

p-nitrophenyl phosphate  +  H2O    →   p-nitrophenol  +  inorganic phosphate

产品内容

YIJI裂解液（Reagent A）   10毫升

YIJI活性液（Reagent B）250微升

YIJI缓冲液（Reagent C）  20毫升

YIJI反应液（Reagent D）   2毫升

产品说明书    1份

保存方式

保存YIJI活性液（Reagent B）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；YIJI反应液（Reagent D）避免光照；有效保证3月；一旦打开使用，有效保证1至2月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

（微型）台式离心机：用于样品制备

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

一、 样品准备

1． 准备好10毫升待测的细菌 

2． 转移到15毫升锥形离心管

3． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为7000g

4． 小心抽去上清液

5． 加入500微升YIJI裂解液（Reagent A），充分混匀

6． 转移到预冷的1.5毫升离心管

7． 加入12.5微升YIJI活性液（Reagent B）

8． 强力涡旋震荡15秒

9． 置于冰槽里15分钟

10． 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

11． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

12． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YIJI30030.1）

13． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测读准备

1．开启分光光度仪预热

2．设定好分光光度仪：温度37℃，波长410nm，间隔60秒，测读6次（共5分钟），并置零

3．YIJI缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定

1． 移取880微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入100微升YIJI反应液（Reagent D）

3． 在37℃温度下孵育3分钟

4． 加入20微升YIJI清理液（Reagent A） 

5． 上下倾倒数次，混匀（5秒钟内）

6． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（5分钟读数－0分钟读数）

四、样品测定

1． 移取880微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入100微升YIJI反应液（Reagent D）

3． 在37℃温度下孵育3分钟

4． 加入20微升待测样品（注意：建议总量20微克细胞总蛋白）

5． 即刻上下倾倒数次，混匀（5秒钟内）

6． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（5分钟读数－0分钟读数）   

五、 计算样品活性

【（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数】÷【0.02（样品容量；毫升）X 15.46（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）】＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔对硝基苯磷酸/分钟

六、 酶标仪测定

1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取220微升YIJI缓冲液（Reagent C）到所有孔里

3． 分别加入25微升YIJI反应液（Reagent D）到所有孔里

4． 在37℃温度下孵育3分钟

5． 分别加入5微升YIJI清理液（Reagent A）或待测样品（10微克细胞总蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）

6． 轻轻摇动96孔板

7． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数

8． 活性计算

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 15.46（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克 

单位＝微摩尔对硝基苯磷酸/分钟

注意事项

1． 本产品为20次（比色皿）或80次（96孔板）操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． 样品避免使用磷酸盐缓冲溶液和EDTA等处理

4． 系统操作过程中，背景测定只需1次

5． 加入样品后5秒内进行比色测定

6． 比色测定后，比色皿须清洗彻底

7． 样本测定吸光读数升高表明具有酶活性

8． 样品测定可以持续5分钟；计算活性时，可以选择其中单位时间（1分钟）的线性吸光读数差值作为样本读数

9． 碱性磷酸酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 8.0的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1微摩尔对硝基苯磷酸

10． 建议待测样本总蛋白浓度为10至20微克/20微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒YIJI30030.1）

11． 本公司提供系列磷酸化酶学检测试剂产品

单组份订购信息

编号名称规格

YIJI50050.4YIJI细菌碱性磷酸酶活性比色法定量检测试剂盒20次

YIJI50050.4AYIJI裂解液（Reagent A）   50毫升

YIJI50050.4B YIJI活性液（Reagent B）    1毫升

YIJI50050.4CYIJI缓冲液（Reagent C）   100毫升

YIJI50050.4D YIJI反应液（Reagent D）    50毫升

YIJI30030.1YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒100次