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现货YIJI细胞EGFR激酶活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒 现货促销
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详细内容
YIJI细胞EGFR激酶活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物,在EGFR激酶敏感性抑制剂存在与否的情况下,受到EGFR磷酸化后,进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应, 即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值的变化,以分析细胞裂解样品中EGFR活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或完全纯化酶样品中EGFR激酶的定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。
技术背景
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor;EGFR;EC2.7.10.1),一种170Kd的跨膜糖蛋白,是表皮生长因子家属成员,属于蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase),是哺乳动物细胞信号的重要分子。EGFR通过和表皮生长因子结合,诱导受体二聚体化和酪氨酸自发磷酸化,调节细胞繁殖、分化、运动、存活,以及溶酶体降解、先天免疫功能等。激活EGFR将触发细胞分裂信号通路,例如ERK、MAPK、Akt、JNK等信号通路。其异常表达或突变与肠癌、肺癌等恶性肿瘤有关。EGFR抑制剂成为临床康肿瘤治疗的靶标。其磷酸化目标序列为ADEYLIPQQ。基于底物ADEYLIPQQ,在EGFR激酶敏感性抑制剂PD153035盐酸盐存在与否的情况下,受到EGFR激酶的磷酸化,获得产物磷酸化多肽,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其吸光峰值的变化(340nm),来定量分析表皮生长因子受体的活性。其反应方式为:
产品内容
YIJI清理液(Reagent A) 毫升
YIJI裂解液(Reagent B) 毫升
YIJI缓冲液(Reagent C) 毫升
YIJI酶促液(Reagent D) 微升
YIJI反应液(Reagent E) 微升
YIJI底物液(Reagent F) 微升
YIJI阴性液(Reagent G) 微升
YIJI专性液(Reagent H) 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存YIJI清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,严格避免光照和反复冻融;有效保证6月
用户自备
EGFR激酶:用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管:用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器
细胞刮脱棒:用于贴壁细胞脱离
(微型)台式离心机:用于细胞预处理
比色皿或酶标板:用于光谱分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪:用于样品光谱分析
实验步骤
一、 待测样品准备
1. 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5 X 106细胞)
2. 小心加入xx毫升YIJI清理液(Reagent A),覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:避免使用胰酶消化)
5. 加入xx毫升YIJI清理液(Reagent A),混匀细胞
6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)
7. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx微升YIJI裂解液(Reagent B),充分混匀
10. 转移到预冷的1.5毫升离心管
11. 强力涡旋震荡15秒
12. 置于冰槽里孵育30分钟
13. 放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
14. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15. 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-YIJI30030.1)
16. 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1. 准备好待测样品(例如细胞裂解悬液等),置于冰槽里
2. 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长为340nm,间隔1分钟,读数6次(共5分钟),并置零
3. YIJI缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度
三、 背景对照测定
1. 移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D)
3. 加入xx微升YIJI反应液(Reagent E)
4. 加入xx微升YIJI底物液(Reagent F)
5. 放进30℃培养箱里静置3分钟
6. 加入xx微升YIJI阴性液(Reagent G)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 -340波长读数5分钟
四、 样品总活性测定
1. 移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D)
3. 加入xx微升YIJI反应液(Reagent E)
4. 加入xx微升YIJI底物液(Reagent F)
5. 放进30℃培养箱里静置3分钟
6. 加入5微升待测样品(注意:50微克细胞裂解蛋白;样品须溶解)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数5分钟
五、 样品非特异活性测定
检测开始前,移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C)到1.5毫升离心管,分别加入xx微升YIJI专性液(Reagent H)和待测样品(注意:50微克细胞裂解蛋白),混匀后,放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
1. 移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D)
3. 加入xx微升YIJI反应液(Reagent E)
4. 加入xx微升YIJI底物液(Reagent F)
5. 放进30℃培养箱里静置3分钟
6. 加入20微升上述预处理的待测样品
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品非特异活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数5分钟
六、 计算样品活性
1) 样品总活性和非特异活性计算
2)样品特异活性计算
六、酶标板测定
1)样品总活性测定
1. 在96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品
2. 分别移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C)到96孔板中
3. 分别加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D)
4. 分别加入xx微升YIJI反应液(Reagent E)
5. 分别加入xx微升YIJI底物液(Reagent F)
6. 轻轻摇动96孔酶标板
7. 在30℃温度下孵育3分钟
8. 分别加入xx微升YIJI阴性液(Reagent G)或待测样品(50微克细胞裂解悬液蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈)
9. 轻轻摇动酶标板
10. 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和5分钟读数
11. 活性计算:
2) 样品非特异活性测定
检测开始前,移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C)到1.5毫升离心管,分别加入xx微升YIJI专性液(Reagent H)和待测样品(注意:50微克细胞裂解蛋白),混匀后,放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
1. 在96孔酶标板上做好相应标记:待测样品
2. 移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C)到96孔板中
3. 加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D)
4. 加入xx微升YIJI反应液(Reagent E)
5. 加入xx微升YIJI底物液(Reagent F)
6. 轻轻摇动96孔酶标板
7. 在30℃温度下孵育3分钟
8. 加入20微升上述预处理的待测样品
9. 轻轻摇动酶标板
10. 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和5分钟读数
11. 活性计算:
3) 样品特异活性计算
七、抑制剂筛选
1. 在96孔酶标板上做好相应标记:背景、完全活性和待测抑制剂样品
2. 按下表加入试剂,进行样品预处理
内容物 | 空背景对照 | 样本背景 | 完全酶活性 | 待测抑制剂酶活性 |
YIJI缓冲液(Reagent C) | xx微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
YIJI阴性液(Reagent G) | xx微升 | xx微升 | xx微升 | —— |
待测抑制剂 | —— | xx微升 | ―― | xx微升 |
用户自备的纯化酶 | —— | —— | xx微升(1毫单位) | xx微升(1毫单位) |
96孔板每孔总量 | 空背景对照孔 (xx微升) | 样本背景孔 (xx微升) | 完全活性孔 (xx微升) | 待测抑制剂样品孔 (xx微升) |
轻轻摇动酶标板,混匀,放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作 |
3. 分别移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C)到新的96孔板的所有孔里
4. 分别加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D)
5. 分别加入xx微升YIJI反应液(Reagent E)
6. 分别加入xx微升YIJI底物液(Reagent F)
7. 轻轻摇动酶标板
8. 在30℃温度下孵育3分钟
9. 加入20微升上述预处理的待测样品
10. 即刻放进30℃酶标仪检测:测读30分钟
11. 抑制活性计算:
注意事项
1. 本产品为20次操作
2. 操作时,须戴手套
3. 系统操作过程中,背景测定只需1次
4. 样品处理忌用磷酸缓冲溶液
5. 样品须澄清,至关重要
6. 如果出现明显的干扰现象,建议使用样本背景对照去除任何内源性干扰因子
7. 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
8. 测定值由高到低变化;测定可持续30分钟
9. 光谱测定后,比色皿须清洗彻底
10. 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
11. 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升(本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-YIJI30030.1)
12. 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
13. 可以使用EGFR抑制剂作为抑制剂对照或阴性对照
14. 表皮生长因子受体激酶活性单位浓度定义:在30℃温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位
15. 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感
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