YIJI组织IKKβ激酶活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

YIJI组织IKKβ激酶活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过人工合成多肽底物，在IKKβ激酶敏感性抑制剂存在与否的情况下，受到IKKβ磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光谱法测定其氧化后峰值的变化，以分析组织裂解样品中IKKβ特异活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中IKKβ激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景

B细胞κ轻链多肽基因促动子抑制剂激酶复合物（Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells，kinase complex；IκB kinase；IKK；EC 2.7.11.10），是NF-κB信号通路中的成员，由3个亚体构成：IKKα，又称为IKK1或CHUK（conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase）；IKKβ，又称为IKK2或IKBKB；IKKγ，又称为NEMO或IKBKG。ITI1、GPRK2L、GPRK4，属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家属中鸟苷酸结合蛋白偶联受体激酶（guanine nucleotide-binding protein-coupled receptor kinase；GRK）亚系成员。多基因GRK亚系由6个成员构成，分成3类：包括GRK1（视网膜色素激酶家系；rhodopsin kinase）、GRK2/3（β肾上腺素能受体激酶；β-adrenergic receptor kinase）以及IKK/5/6（IKK激酶）。其中G蛋白偶联受体激酶4至少有4种变异体：IKKα、β、γ、δ，在睾丸组织中高度表达。IKK使G蛋白偶联受体，例如多巴胺等去敏化（desensitization）、以及精子授精等有关。其目标蛋白为活化的G-蛋白偶联受体蛋白，进行磷酸化后，抑制其功能。其功能异常将导致遗传性或获得性高血压等疾病。其磷酸化目标序列为RRREEEEESAAA。基于底物RRREEEEESAAA，在IKKβ激酶敏感性抑制剂5-苯基-3-脲啶噻吩-2-甲酰胺（（5-phenyl-3-ureido）-thiophene-2-carboxamide）存在与否的情况下，受到IKKβ激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析IKKβ的特异活性。其反应方式为：

产品内容

YIJI清理液（Reagent A）  毫升

YIJI裂解液（Reagent B）  毫升

YIJI缓冲液（Reagent C） 毫升

YIJI酶促液（Reagent D） 微升

YIJI反应液（Reagent E） 微升

YIJI底物液（Reagent F）  微升

YIJI阴性液（Reagent G） 微升

YIJI专性液（Reagent H） 微升

产品说明书   1份

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

IKKβ激酶：用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

（微型）台式离心机：用于组织预处理

比色皿或酶标板：用于光谱分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪：用于样品光谱分析

实验步骤

一、 待测样品准备

1． 手术取出动物组织，并秤重500毫克组织重量 

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗

4． （选择步骤）抽去清理液

5． 移入到一个液氮冻存管

6． 即刻放进液氮罐过夜

7． 次日从液氮罐里取出，即刻（*快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

8． 放进一个15毫升锥形离心管

9． 加入置于冰槽里的xx微升YIJI裂解液（Reagent B） 

10． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀

11． 放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

12． 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g 

13． 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管

14． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）

15． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如组织裂解悬液等），置于冰槽里 

2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零

3． YIJI缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1． 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）

4． 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入xx微升YIJI阴性液（Reagent G）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

四、 样品总活性测定

1． 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）

4． 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入5微升待测样品（注意：50微克组织裂解蛋白；样品须溶解）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟 

五、 样品非特异活性测定

检测开始前，移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入xx微升YIJI专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50微克组织裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。

1． 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）

4． 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入20微升上述预处理的待测样品

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

六、 计算样品活性

1） 样品总活性和非特异活性计算

2）样品特异活性计算

七、酶标板测定

1）样品总活性测定

1． 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到96孔板中

3． 分别加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）

4． 分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）

5． 分别加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）

6． 轻轻摇动96孔酶标板

7． 在30℃温度下孵育3分钟

8． 分别加入xx微升YIJI阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克组织裂解悬液蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）

9． 轻轻摇动酶标板

10． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数

11． 活性计算：

2） 样品非特异活性测定

检测开始前，移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入xx微升YIJI专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50微克组织裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。

1． 在96孔酶标板上做好相应标记：待测样品

2． 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到96孔板中

3． 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）

4． 加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）

5． 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 

6． 轻轻摇动96孔酶标板

7． 在30℃温度下孵育3分钟

8． 加入20微升上述预处理的待测样品

9． 轻轻摇动酶标板

10． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数

11． 活性计算：

3） 样品特异活性计算

八、抑制剂筛选

1． 在96孔酶标板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品

2． 按下表加入试剂，进行样品预处理

3． 分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里

4． 分别加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）

5． 分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）

6． 分别加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 

7． 轻轻摇动酶标板

8． 在30℃温度下孵育3分钟

9． 加入20微升上述预处理的待测样品

10． 即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟

11． 抑制活性计算：

注意事项

1． 本产品为25次操作，包括背景操作

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 样品处理忌用磷酸缓冲溶液 

5． 样品须澄清，至关重要 

6． 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定

7． 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟

8． 光谱测定后，比色皿须清洗彻底

9． 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性

10． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1） 

11． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

12． 可以使用IKKβ抑制剂作为抑制剂对照或阴性对照

13． IKKβ活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

14． 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感

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上海一基实业有限公司

原创作者：上海一基生物试剂有限公司