BCA蛋白浓度测定法是常用的蛋白浓度检测方法， BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。本试剂盒测定蛋白浓度灵敏度高，检测浓度下限达到25µg/ml，小检测蛋白量达到0.5µg，待测样品体积为1-20µl。在50-2000µg/ml浓度范围内有较好的线性关系。而且不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于0.01%。

试剂盒组份

组   份（50ml）（100ml） 存储温度

蛋白标准溶液（ 5μg/μL ） 5 mL 10 mL -20℃

BCA试剂A 50 mL 100 mL 4℃

BCA试剂B 1 mL 2 mL 4℃

试剂盒以外自备仪器和试剂

可调移液器、1.5m L离心管或96孔板、涡旋振荡器、酶标仪或分光光度计（测定波长为540-595nm之间，562nm佳）。

操作步骤

A、普通分光光度计操作  1、 估计样品蛋白的浓度范围，并将样品稀释至合适浓度。2、 BCA工作液的准备：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。

管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8（…样品）

蛋白标准溶液（μL） 0 5 10 20 40 60 80 100 0

去离子水（μL） 100 95 90 80 60 40 20 0 100－X

样品（μL） 0 0 0 0 0 0 0 0 X

BCA工作液（μL） 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

对应蛋白含量（μg） 0 2.5 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 待测3、 取若干个带盖的1.5 mL离心管，编好号后，按下表加入试剂： 4、 各管充分混匀，37℃放置30分钟，然后以0号管做参比在562nm下比色测定，记录各管的吸光值。根据管号1、2、3、4、5、6、7的吸光值以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。5、 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白质含量（μg）， 除以加入样品的体积（XμL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度。 B、酶标板操作1、 估计样品蛋白的浓度范围，并将样品稀释至合适浓度。2、 BCA工作液的准备：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。3、 取一块酶标板，按照下表加入试剂：

孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 8（…样品）

蛋白标准溶液（μL） 0 1 2 4 8 12 16 20 0

去离子水（μL） 20 19 18 16 12 8 4 0 20－X

样品（μL） 0 0 0 0 0 0 0 0 X

BCA工作液（μL） 200 200 200 200 200 200 200 200 200

对应蛋白含量（μg） 0 5 10 20 40 .0 80 100 待测 4、 把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟再次振荡，然后以0号孔在562nm下用酶标仪进行比色测定。记录各孔的吸光值。根据孔号1、2、3、4、5、6、7的吸光值以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。5、 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白质含量（μg）， 除以加入样品的体积（XμL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度。

保存条件

蛋白质标准溶液-20℃保存，BCA试剂A 和BCA试剂B 4℃保存，一年有效。

注意事项

1、 BCA试剂A 和BCA试剂B使用请颠倒3-5次，混匀。2、 配制好的混合BCA工作液室温24小时内稳定。3、 加入BCA工作液后，也可以在室温放置2小时测定。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深，并且显色反应会因温度升高而加快。实验中可对作用温度和作用时间进行优化，如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。4、 蛋白标准液请在使用先混匀，再稀释成一系列不同浓度的蛋白标准。5、 比色应在2h内完成。6、 请穿实验服并戴一次性手套操作。