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高效液相色谱法检测黄曲霉毒素M1操作规程
点击次数：704 发布时间：2012/9/7 8:45:30
. 仪器
1.1 高效液相色谱仪配荧光检测器
1.2 均质匀浆机
1.3 高速离心机
2. 试剂与试液
2.1 色谱甲醇
2.2 蒸馏水
2.3 乙腈+水（25+75）
2.4 石油醚
2.5 10%乙腈
2.6 氢氧化钠溶液（0.5mol/L）
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3. 测定法
本法系用高效液相色谱法（GB/T 18980-2003）测定牛奶，奶粉等产品中的黄曲霉毒素M1，除另有规定外，按下列方法测定。
3.1 色谱条件
色谱柱：C18柱，150×4.6mm，5um
检测器：荧光检测器；激发波长365nm，发射波长435nm；
流动相：乙腈-水（25：75）
流 速：1.0ml/min
进样量：20ul
柱 温：室温
3.2 标准品溶液的配制
取黄曲霉毒素M1标准品，用乙腈稀释成0.5ug/ml的标准储备液。根据使用需要，准确吸取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl的黄曲霉毒素标准储备液，置5ml的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配成相当于1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液，即得。
3.3 样品前处理
3.3.1牛奶
将100mL牛奶水浴加热至40℃；
4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用；
3.3.2乳粉和粉状婴幼儿配方食品
称取10g奶粉样品，将100mL50℃水多次少量加入，搅拌，使奶粉充分溶解；
6000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用；
3.3.3发酵乳（包括固体状、半固体状和带果肉型）
称取60 g混匀的试样，用0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液在酸度计指示下调pH至7.4；
用OmniPrep多样品均质仪在 18000rpm ，高速匀浆60秒或Bead Ruptor 24多样品研磨珠均质仪 在6m/s 研磨30秒 中途间隔10秒
水浴加热至40℃；
4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用
3.3.4干酪
称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g置于50 mL离心管中，加2 mL水和30 mL甲醇；
用OmniPrep多样品均质仪在 18000rpm ，高速匀浆60秒或Bead Ruptor 24多样品研磨珠均质仪 在6m/s 研磨30秒 中途间隔10秒 ；
超声提取30 min；
在6000r/分钟下离心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。
在分液漏斗中加入30 mL石油醚，振摇2 min；
待分层后，将下层移于50 mL烧杯中，弃去石油醚层。
重复用石油醚提取2次；。
将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至约2 mL；
浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液（1+4） 5 mL分2次洗涤，洗涤液一并倒入50 mL离心管中；
加水稀释至约50 mL，在6000 转/分钟下离心 5 min，上清液供净化处理。
3.3.5奶油
称取5g试样，置于50 mL烧杯中；
用20 mL石油醚将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。
加20 mL水和30 mL甲醇，振荡30 min后，将全部液体移于分液漏斗中；
待分层后，将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪中减压浓缩至约5 mL，加水稀释至约50mL，供净化处理。
3.4 供试品溶液的制备
3.4.1 PriboFast® 黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的操作
将免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。准确移取50.0mL净化溶液注入玻璃注射器；
将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约2-3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体；
更换10ml注射器与亲和柱连接，在注射器中加入10ml水，调节压力使水以约6mL/min流速清洗亲和柱。
准确加入4mL色谱级乙腈洗脱，流速为1 mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。（建议将乙腈的量分2-4次加入。每次加入后，要让甲醇充分浸泡柱子里的凝胶2分钟。洗脱后的乙腈溶液，是水浴30℃加热吹近干。用10%乙腈定容后上液相）
3.5 测定
精密量取1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液各20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。另精密量取供试品溶液20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素M1的量，计算，即得。
1.本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。
2.残留有黄曲霉毒素M1的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。
原创作者：北京平利洋公司
