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中药中黄曲霉素B1的检测与控制
点击次数：1680 发布时间：2012/9/7 9:05:46
真菌毒素（mycotoxins）是真菌的次级代谢产物，是农产品的主要污染物，目前已知的真菌毒素有200多种，其中研究较为深入的有十几种。对世界上30多个国家和地区进行了调查，结果表明，危害程度排在位的是黄曲霉毒素（aflatoxins, AF，包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1）。
黄曲霉毒素是自然界天然存在的真菌毒素，它主要是由以下两种霉菌产生的：黄曲霉Aspergillus flavus和寄生曲霉 Aspergillus parasiticus。Aspergillus flavus非常常见且广泛分布于自然界，在谷物生长的非常艰苦的条件下，比如干旱，也可以找到。这种霉菌存在油、变质的蔬菜、干草以及任何适合它生长的地方。*适合其生长的条件为高温高湿。在天然条件下，它至少产生13种黄曲霉毒素，其中黄曲霉素B1毒性*强 。
黄曲霉毒素是由一组大约20种相关的真菌代谢产物组成，但一般在植物原来的食物中只发现黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2。黄曲霉素B2和G2是母体化合物的双氢衍生物。Aspergillus属真菌中至少有三种菌能产生黄曲霉毒素：A. flavus, A. parasiticus ａnd A. nomius。它们广泛存在于许多重要的食品商品中，其中包括谷物、坚果、香料、无花果和干果中。
具有关部门调查从17个省的粮食抽样中测得黄曲酶毒素的情况分析数据说明。全国的分布情况；华中、华南、华北产毒株多、产毒量也大，而东北、西北地区则较少。
奶牛和一些反刍性动物摄取了黄曲霉毒素污染的饲料以后，黄曲霉毒素B1和B2被代谢成黄曲霉毒素M1和M2。它们会被分泌到牛奶中，继而进一步污染干酪和酸乳酪等食品
污染对象及其后果
真菌毒素污染*严重的农产品是玉米、花生和小麦，人类和动物摄入被真菌毒素污染的农产品后可导致急慢性中毒，称为真菌毒素中毒症。
历史上由真菌毒素导致的中毒事件层出不穷，即使是今天，特别是亚热带发展中国家，真菌毒素仍是某些疾病甚至死亡的主要原因。
真菌毒素对我国农产品的影响
我国是一个农业大国，小麦、玉米、大米及花生等是居民的主要食品原料，各类粮油食品均不同程度地被真菌及其毒素污染，几乎所有的真菌毒素在我国农产品中均可检出。我国每年约有2%的（二千五百万公斤）的粮食因受真菌毒素污染而不能食用。
黄曲霉素介绍
是真菌毒素的重要代表，是由黄曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉产生的一组结构类似，对肝脏剧毒，并有致畸、致突变和致癌作用的天然污染物。已发现AF的衍生物有20多种，其中，被癌症研究机构列为I级致癌剂的AFB1毒性，低剂量长期摄入或大剂量一次暴露均可引发多种动物肝脏发生癌变或急性中毒。 上以黄曲霉毒素、苯并毒性作用作为10，000，别的物质与之相比。
毒性及控制的重要性
人类的癌症65%以上是因为食物被污染引起的，某些霉菌污染食物后产生的毒素，可导致人类中毒或诱发癌变，其中*危险的一种就是黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是一类具有强荧光性质的致癌、致畸的有毒物质，急性毒性大于，慢性毒性可诱发肝癌，致癌能力为奶油黄的900倍，为二甲基亚硝胺的75倍。黄曲霉毒素的种类目前已确定的有B1、B2、G1、G2、M1和M2等17种，其中6种有强毒性，以B1为*强，M1、G1次之，较弱的有B2、G2、M2等 。
原发性肝细胞癌在美国及西欧一些国家非常罕见，却是非洲及东南亚地区常见的恶性肿瘤。在我国，原发性肝细胞癌年发病人数为110200人，占世界总病例数的45%。其地理分布资料显示，高发区位于江苏、浙江、福建、广东及广西等气候条件适于黄曲霉生长繁殖、具有亚热带气候特点的东南沿海岸线。
奶牛摄食被AFB1和AFB2污染的饲料后，在牛奶和尿中可检出其羟基化代谢产物AFM1和AFM2。AFM1除了随乳汁排出外，还有部分存留在肌肉中。饲料中的AFB1约有1-6%在奶牛体内转化成AFM1出现在牛奶中。
黄曲霉毒素的理化性质
黄曲霉毒素是晶体物质，是一组化学结构类似的二呋喃香豆素的衍生化合物，分离鉴定出12种其中4种B1、2，G1、2，和代谢产物M1、2可直接污染食品和饲料。易溶于氯仿、甲醇和二甲基亚砜等中等极性溶剂中，能溶于水，浓度范围为10-20mg/L。在紫外光照射下产生荧光。
结晶性黄曲霉毒素在避光条件下，尤其是避免紫外光的照射，即使在100℃以上高温时其性质仍特别稳定。黄曲霉毒素氯仿溶液或苯溶液在避光、低温条件下可稳定保存数年。黄曲霉毒素内酯环在碱性水解条件下易开环，已有报道用氨气和次氯酸盐来除去食物商品中的黄曲霉毒素，
AFB1难溶于水，易溶于甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH 9-10的强碱溶液中分解迅速，但此反应可逆，即在酸性条件下又能恢复原来结构。
AFB1对热非常稳定, 268-269℃方可破坏, 故一般烹调温度不破坏其毒性。某些化学试剂如5%次氯酸钠和丙酮可使AFB1完全分解，因此在实验室中用此方法对接触过AFB1的器皿作解毒处理。但在紫外线照射可使之分解。
经衍生化提高其检出限
测定黄曲霉毒素的条件
由于黄曲霉毒素分子结构缺乏具有活性的功能基团与荧光基团直接反应， 需要先行衍生化，然后再与荧光基团直接反应或用荧光检测器HPLC色谱仪进行检视
应用于谷物、食品中黄曲霉毒素的分析方法
应用*广泛的黄曲霉毒素定量方法
主要是薄层色谱（TLC）
高效液相色谱（HPLC），黄曲霉毒素可通过正相或反相HPLC分离然后用荧光检测器检测。
二维薄层色谱（2D-TLC）和高效薄层色谱（HPTLC）也是较为常用的检测手段，而凝胶渗透色谱则不太常用。另外一些可用于分析检测黄曲霉毒素的方法还有气相色谱-质谱联用技术、电泳以
ELISA（免疫酶标法）。Themo MK3 FC 酶标仪洗板机 配相应ELISA试剂盒
电化学法 、放射免疫法、电化学分析
测定方法的选择1
由于上述各国对黄曲霉毒素的限量控制的非常严格，一般控制在（越来越严）NG、PG级，所以要求其方法的检出限极低。常规的分析方法难以达到实验要求。现通行的测试方法，柱前、后衍生化HPLC荧光检测方法。以溴、碘作衍生化剂。而对中药中的黄曲霉毒素的测定报道近几年才有。
测定黄曲霉毒素的过程分三步：提取、净化与富集、定量检测。
测定方法的选择2
免疫亲合柱净化、柱后溴衍生化HPLC荧光检测方法的选择性强，首先用免疫亲合柱净化待测样品，然后进行衍生化，又采用的液相色谱仪测定其主要的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的总量，数据可靠。
从实验及文献得到的试验数据看,采用的免疫酶标法（ELISA）的数据较高，分析可能是假阳性。另外,所用的试剂盒价钱昂贵。
中药中的黄曲霉毒素的测定
早在八十年代就展开对中药中黄曲霉毒素进行测定，采用的是免疫酶标法（ELISA）由于免疫试剂盒较昂贵，误差大，就未进行深入的方法学研究。 ELISA与亲合柱HPLC测定中药黄曲霉毒素进行了深入对比试验。并将现通行的免疫亲合柱HPLC方法，成功的应用到中药中黄曲霉毒素的测定
对中药材（核桃仁、酸枣仁、神曲及意苡仁等。
中药制剂（有 发酵辅料或发酵工艺的产品）
中药（材、制剂）黄曲霉毒素的安全控制
1避免黄曲霉毒素的污染
1.1黄曲霉毒素一旦产生，它是十分稳定的。加热、冷冻都无法去除。经研究在食品中相当稳定，很难降解。降低食品中黄曲霉毒素含量的处理方法的效果被很多因素所影响，例如蛋白质的存在、PH值、温度以及处理时间的长短。一般农产品清除黄曲霉毒素的商业处理包括去除坏掉的部分、谷类的外壳以及花生的拣选。
1.2 尽可能的减少在中药材种植及储藏过程中感染霉菌的情况发生。（穗外观健康的玉米一般很少是被霉菌污染的）
降低收获过程中对霉坏部分的机械破坏（外伤后引发的污染）采收后及早干燥。
储存过程中降低黄曲霉毒素污染也是一个重要途径。
中药材的流通、临床用饮片、制药的原料等。
2实施严格的检测标准
我国的检验体系欠发达，以美国为例，现有近60种认证体系。对重金属、农药残留、食物添加剂、色素、致病菌等制订了严格的技术标准。其中一项不达标，产品不得进入美国市场 。
中药中的黄曲霉毒素测定方法已经列入药典附录。
黄曲霉毒素的分析方法
应用*广泛的黄曲霉毒素定量方法
主要是薄层色谱（TLC）
高效液相色谱（HPLC），黄曲霉毒素可通过正相或反相HPLC分离然后用荧光检测器检测。
二维薄层色谱（2D-TLC）和高效薄层色谱（HPTLC）也是较为常用的检测手段，而凝胶渗透色谱则不太常用。另外一些可用于分析检测黄曲霉毒素的方法还有气相色谱-质谱联用技术、电泳以及ELISA（免疫酶标法）。
电化学法 、放射免疫法、电化学分析
目前我国食品AFB1限量标准
| 食品名称 | 限量 μg/kg |
| 玉米、花生、花生油 | ≤20 |
| 大米、其他食用油 | ≤10 |
| 其它粮食、豆类、发酵食品 | ≤ 5 |
| 精练食用植物油 | ≤ 5 |
| 发酵性豆制品 | ≤ 5 |
| 淀粉制品 | ≤ 5 |
| 糕点、面包 | ≤ 5 |
| 膨化食品 | ≤ 5 |
| 辅照干果、果脯（花生仁） | ≤ 20 |
| 食品名称 | 限量μg/kg |
| 绿色食品 玉米 | ≤ 5 |
| 豆油 | ≤5 |
| 花生 | ≤10 |
| 大豆 | ≤5 |
| 无公害食品 豆腐 | ≤ 5 |
| 大米 | ≤ 0.5 |
| 花生、谷物 | ≤2 |
| 药用植物及制剂 | ≤ 5 |
中药（材、制剂）黄曲霉毒素的安全控制
1避免黄曲霉毒素的污染
1.1黄曲霉毒素一旦产生，它是十分稳定的。加热、冷冻都无法去除。经研究在食品中相当稳定，很难降解。降低食品中黄曲霉毒素含量的处理方法的效果被很多因素所影响，例如蛋白质的存在、PH值、温度以及处理时间的长短。一般农产品清除黄曲霉毒素的商业处理包括去除坏掉的部分、谷类的外壳以及花生的拣选。
1.2 尽可能的减少在中药材种植及储藏过程中感染霉菌的情况发生。（穗外观健康的玉米一般很少是被霉菌污染的）
降低收获过程中对霉坏部分的机械破坏（外伤后引发的污染）采收后及早干燥。
储存过程中降低黄曲霉毒素污染也是一个重要途径。
中药材的流通、临床用饮片、制药的原料等。
2实施严格的检测标准
我国的检验体系欠发达，以美国为例，现有近60种认证体系。对重金属、农药残留、食物添加剂、色素、致病菌等制订了严格的技术标准。其中一项不达标，产品不得进入美国市场 。
中药中的黄曲霉毒素测定方法尚未列入药典附录，具体品种未给出限量标准。
测定黄曲霉毒素对实验室的要求
鉴于上述黄曲霉毒素的毒性对人体的危害性大，对实验室和实验操作人员都有严格的规定和要求；
本实验必须要有专用的实验室，有条件实验操作台和测定仪器房间为一体。（里外间，防止毒性物质外泄，二次污染或中毒）
实验室要有符合要求的通风设备，所用的试验器皿要专门清洗，试验的废液要按要求处理。
注意事项
实验应在通风橱中完成操作，当毒物处于干燥状态时因为静电作用会导致其分散在空气中，所以应进行必要的防护。
如果黄曲霉毒素不小心溅出，可用次氯酸钠漂白剂处理。
对接触过黄曲霉毒素的所有玻璃器皿用1％次氯酸钠和丙酮清洗。
操作时应戴一次性手套，使用完毕后应丢弃接触过可能含有毒物的手套。如果手被污染了，应先用未稀释漂白剂洗再用肥皂清洗。
原创作者：北京平利洋公司
