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组织均质匀浆中 蛋白提取

点击次数:3003 发布时间:2012/8/20 7:41:01

整个组织(或者一部分组织,比如1克,具体需要考虑组织的大小和所含药物量及方法的检测限),置于适当的容器中(比如试管,2ml 15ml),加入适当体积的适当溶剂(体积可采用1:2,即1g组织用2ml溶剂,至于溶剂的种类,可选择水、甲醇、乙腈等,具体需要考虑药物的溶解性),然后以 18000rpm的OmniTH Prep多样品剪切匀浆机 或 6m/s  Omni Bead Ruptor 24多样品研磨珠进行匀浆 (时间大约1min),直至获得均一的匀浆液,然后超声5min(为充分溶出药物,但须考虑药物的稳定性)、3500g离心5min,分取上清液。然后按照与血浆的预处理方法继续处理进样测定即可。

上述操作的主要目的是将组织细胞中的药物完全溶解出来,从而能够测定全部的药物浓度。因此如果采用细胞破碎仪OMNI Sonic Ruptor 250和Sonic Ruptor 400也可以。
 
但在操作中需要考虑药物的稳定性。毕竟高速匀浆会产热导致药物降解。

匀浆时保持低温,因为30度左右代谢酶会产生活性,可能会影响测定结果。
 
匀浆的目的是什么?应该是测里面的某种成分的含量或活性吧,或者其他目的。冰水浴的目的是什么?防止活性成分分解或灭活。如果你要测的东西稳定性做够好,没必要冰水浴
组织匀浆的时候需要在冰上操作,加蛋白酶抑制剂
尽量在冰上,温度当然是低些,以防蛋白降解还怕尿素分解,以致于氨甲基化修饰蛋白,影响后面的质谱鉴定
控制在低温  不要连续匀浆可以每匀浆10秒 就把匀浆的容器放置于冰水混合物中降温,然后再匀浆,这样可以减少对目的物的损伤
操作步骤:参照《蛋白质技术手册》
1、用组织剪或手术刀迅速将清洗的组织分离成适宜的小块,如1cm^3
2、每体积湿重组织通常加3~5倍体积预冷的匀浆缓冲液至匀浆容器内
3、制备匀浆:1)手动的玻璃匀浆器匀浆10-20次。2)剪切式组织匀浆均质以10000-28000rpm的速度,高速匀浆3次,每次10秒,次间暂停几秒。3) 24多样品研磨珠均质仪以线速度6.5m/s,高速匀浆3次, 每次15秒 , 次间间隔10秒。
4、离心去上清,转速可参照 3,000. rpm/15  minutes/4'C
5组织匀浆经提取液提取后得到的应是组织细胞的总蛋白质
 
注意事项:
避免血液影响:1 充分放血 (找到颈动脉或股动脉,剪断,放血会比较充分)。
2 对于血流较丰富的器官,比如肝脏,可用生理盐水从肝门静脉灌流冲洗。
3匀浆过程应注意维持低温,可外置冰水浴  Omni公司 两款设备可选配冰槽 和Cryo 24多样品研磨珠均质仪冷却单元
 

原创作者:北京平利洋公司

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