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组织均质匀浆中 蛋白提取
点击次数：3000 发布时间：2012/8/20 7:41:01
| 整个组织（或者一部分组织，比如1克，具体需要考虑组织的大小和所含药物量及方法的检测限），置于适当的容器中（比如试管，2ml 15ml），加入适当体积的适当溶剂（体积可采用1:2，即1g组织用2ml溶剂，至于溶剂的种类，可选择水、甲醇、乙腈等，具体需要考虑药物的溶解性），然后以 18000rpm的OmniTH Prep多样品剪切匀浆机 或 6m/s Omni Bead Ruptor 24多样品研磨珠进行匀浆 （时间大约1min），直至获得均一的匀浆液，然后超声5min（为充分溶出药物，但须考虑药物的稳定性）、3500g离心5min，分取上清液。然后按照与血浆的预处理方法继续处理进样测定即可。 上述操作的主要目的是将组织细胞中的药物完全溶解出来，从而能够测定全部的药物浓度。因此如果采用细胞破碎仪OMNI Sonic Ruptor 250和Sonic Ruptor 400也可以。 但在操作中需要考虑药物的稳定性。毕竟高速匀浆会产热导致药物降解。 匀浆时保持低温，因为30度左右代谢酶会产生活性，可能会影响测定结果。 匀浆的目的是什么？应该是测里面的某种成分的含量或活性吧，或者其他目的。冰水浴的目的是什么？防止活性成分分解或灭活。如果你要测的东西稳定性做够好，没必要冰水浴 组织匀浆的时候需要在冰上操作,加蛋白酶抑制剂 尽量在冰上,温度当然是低些,以防蛋白降解还怕尿素分解,以致于氨甲基化修饰蛋白,影响后面的质谱鉴定 控制在低温 不要连续匀浆可以每匀浆10秒 就把匀浆的容器放置于冰水混合物中降温，然后再匀浆，这样可以减少对目的物的损伤 操作步骤：参照《蛋白质技术手册》 1、用组织剪或手术刀迅速将清洗的组织分离成适宜的小块，如1cm^3 2、每体积湿重组织通常加3~5倍体积预冷的匀浆缓冲液至匀浆容器内 3、制备匀浆：1）手动的玻璃匀浆器匀浆10－20次。2）剪切式组织匀浆均质以10000－28000rpm的速度，高速匀浆3次，每次10秒，次间暂停几秒。3） 24多样品研磨珠均质仪以线速度6.5m/s，高速匀浆3次， 每次15秒 ， 次间间隔10秒。 4、离心去上清，转速可参照 3,000. rpm/15 minutes/4＇C 5组织匀浆经提取液提取后得到的应是组织细胞的总蛋白质 注意事项： 避免血液影响：1 充分放血 （找到颈动脉或股动脉，剪断，放血会比较充分）。 2 对于血流较丰富的器官，比如肝脏，可用生理盐水从肝门静脉灌流冲洗。 3匀浆过程应注意维持低温，可外置冰水浴 Omni公司 两款设备可选配冰槽 和Cryo 24多样品研磨珠均质仪冷却单元 |
原创作者：北京平利洋公司
