大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验。

1 使用目的：

本试剂盒用于饲料、鱼、虾和肉类组织（如鸡、牛肉和猪肉），药物、血清和尿样中大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）残留的定量检测。

2 实验原理

本试剂盒采用竞争ELISA方法，在微孔板包被有大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）偶联抗原，加入大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）标准品或样品，游离大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）与微孔条上预包被的大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）偶联抗原互相竞争抗大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）抗体酶标记物，用TMB底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在450nm波长下进行检测，吸光值与样品中大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）含量成反比，通过标准曲线计算样品中大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）的含量。  

3 试剂盒组成

3.1 预包被的大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）偶联抗原的可拆酶标板：1块（12孔×8条）。
3.2大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）标准品：6瓶（1ml/瓶），含量分别是：0ug/ml, 0.1 ug/ml,0.3 ug/ml,0.9 ug/ml,2.7 ug/ml,8.1 ug/ml

3.3抗大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）抗体酶结合物：1瓶（6ml）。
3.4显色液A：1瓶（6ml）。
3.5显色液B：1瓶（6ml）。
3.6终止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
3.7样本稀释液：1瓶（10×,  6ml），用于样品稀释用。
3.8浓缩洗涤液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
3.9说明书一份。

4 需要而未提供的材料
4.1 设备
4.1.1波长450nm酶标仪。
4.1.2粉碎机。
4.1.3量筒。
4.1.4振荡器。
4.1.5漏斗。
4.1.6Whatman No 1或相当的滤纸。
4.1.7微量移液器。
4.2 试剂
4.2.1去离子水或蒸馏水。
4.2.2 甲醇。
5 贮存
5.1 试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻
5.2 未用完的微孔板应该密封干燥保存
6 注意事项
6.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。
6.2 不要使用过期试剂盒。
6.3 试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温2小时。
6.4 标准品中含有大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P），使用时应特别注意，操作时应带手套。
6.5 终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。
6.6 不同标准品、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。
6.7 不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响实验结果。
6.8 稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果
6.9 混合试剂时应避免起泡。
7 工作液准备
7.1大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）标准品溶液：0ug/ml, 0.1 ug/ml,0.3 ug/ml,0.9 ug/ml,2.7 ug/ml,8.1 ug/ml

7.2 浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20（1+19）稀释备用

7.3 样本稀释液：用蒸馏水按1:10（1+9）稀释备用
7.3 显色剂：已备用，避免光线直照
7.4 反应终止液：已备用
8 样品处理：（样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存）

一般样品处理

8.1取10g粉碎的样品，加 20ml 70%甲醇溶液
8.2强力振荡3分钟
8.3用Whatman No 1滤纸过滤
8.4取100µl处理后的样品，加入400µl样本稀释液
8.5取100μl稀释液进行分析

动物组织前处理

8.6准确称取1±0.05 g匀浆后的组织样品到50 ml的聚苯乙烯离心管中；加入3ml乙腈－－丙酮提取溶液，2000rpm剧烈震荡20s后4000r/min以上离心5min

8.7取上清液0.8ml在50℃氮气流下吹干

8.8加入3.2mL样品稀释液, 750rpm涡旋20s

8.9取100ml用于分析 

饲料前处理方法

8.10准确称取1±0.05 g粉碎饲料样品到50 ml的聚苯乙烯离心管中；加入4ml乙腈，1ml丙酮，2000rpm剧烈震荡20s后4000r/min以上离心3min

8.11取上清液0.7ml在50℃氮气流下吹干

8.12加入2.8mL样品稀释液,涡旋20s，混匀后取100ml用于分析

牛奶前处理方法

8.13取1 ml牛奶样品到5 ml聚苯乙烯离心管中；加入4ml样品稀释液，混匀后取100ml用于分析

奶粉前处理方法

8.14准确称取0.3g奶粉样品到7 ml的聚苯乙烯离心管中；加入2ml PBS溶液，2 ml正己烷，震荡混匀

8.154000r/min以上离心5min，去除有机层和中间层，取下层溶液100ml到400ml 样品稀释液

8.16混匀后取100ml用于分析 

9 酶免分析步骤
9.1 实验须知
9.1.1 实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温（25±2℃），时间约2小时。回温至室温（25±2℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保证回温充分，否则影响检测的精确度和准确度。
9.1.2 使用后请立即将试剂放回2~8℃保存
9.1.3 请不要改变分析程序
9.1.4 请使用精确的微量移液器
9.1.5 操作一旦开始，请不要中断任何程序
9.1.6 ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作
9.1.7 为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样
9.1.8 加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面
9.2 分析步骤
9.2.1 预行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测
9.2.2 取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存
9.2.3 样品稀释液、浓缩洗涤液（20×）稀释成工作液（蒸馏水或去离子水稀释）
9.2.4 在B0孔中加入50µl0.0 ug/ml标准品溶液
9.2.5 在各标准孔中加入50μl的标准品溶液
9.2.6 在各样品孔中加入50µl样品溶液
9.2.7 在所有孔中加入50µl的抗大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）抗体酶结合物
9.2.8 轻轻晃动反应板几秒钟。
9.3 37℃温浴30min （温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差）
9.3.1 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，*后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。
9.4 反应
9.4.1 洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50µl显色液A，再加 50µl显色液B；轻微晃动反应板使之彻底混匀
9.4.2 37℃温浴10min
9.4.3 每孔中加入50µl终止液，混匀
9.4.4 在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。
10 结果计算
10.1定量分析
10.1.1所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0 ug/ml标准溶液的平均吸光度值
10.1.2以大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）浓度的对数值，求得反对数即为测定液中大肠杆菌宿主残留蛋白（E.coli P）浓度C（ug/ml）
10.1.3由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。
10.2 半定量测定
10.1.1目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。
10.1.2仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。