（一）蛋白印迹仪操作规程

免疫印迹法操作步骤

推荐访问：免疫印迹法临床应用免疫印迹主要试剂免疫印迹分类和原理免疫印迹法实验原理和目的免疫印迹法原理、试剂准备和注意事项

免疫印迹法就是将蛋白质往膜上转移，之后利用抗体进行检测。能够使用相应抗体作为一抗对已知表达蛋白进行检测，能够通过融合部分的抗体对新基因的表达产物进行检测。

 

操作步骤

 

一、获取蛋白质样品：

 

细菌诱导表达后，能够通过电泳上样缓冲液将细胞直接裂解，将匀浆缓冲液加在真核细胞上，机械或超声波室温匀浆0.5-1分钟。之后4摄氏度下13,000g离心15分钟，取上清液作为样品。

 

二、电泳：

 

对电泳凝胶进行制备，进行SDS-PAGE。

 

 

三转移：（半干式转移）

 

1、完成电泳后将胶条切成合适大小，使用转膜缓冲液平衡，分别进行3次，每次5分钟。

 

2、膜处理：将与胶条同样大小的滤纸和NC膜预先裁好，将其在转膜缓冲液中浸没10分钟。

 

3、转膜：转膜装置按照从下至上的顺序依次将阳碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴碳板放好，精确对齐滤纸、凝胶、NC膜，每一步均将气泡去除，将500g重物压上，吸干碳板上多余的液体。将电源接通，恒流1mA/cm2，转移1.5hr。完成转移后，将电源断开，取出膜，对待测膜条割取来做免疫印迹。在膜染色液中放入有蛋白标准的条带染色50之后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干，保存在两层滤纸之间，和显色结果对比。

 

四免疫反应：

 

1、洗膜使用0.01M PBS进行清洗，每次5分钟，一共3次。

 

2.将包被液加入加入，室温下保持2小时。

 

3.将包被液弃掉，洗膜使用0.01M PBS进行清洗，每次5分钟，一共3次。

 

4.将一抗加入（用0.01M PBS根据合适稀释比例进行稀释，膜必须全部为液体所覆盖），在4摄氏度下放置超过12小时，阴性对照，一抗使用1%BSA替代，其余步骤和实验组一样。

 

5.将1%BSA和一抗弃掉。膜使用0.01M PBS分别进行清洗，每次5分钟，一共4次。

 

6、将辣根过氧化物酶偶联的二抗加入（用0.01M PBS根据合适稀释比例进行稀释），平稳摇动，室温下保持两