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人乙酰胆碱Elisa试剂盒上海恒远说明书
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上传时间：2015/3/25 15:29:40
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上 传 者：恒远免疫学第三方检测中心
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货号：HY-11525K
人乙酰胆碱(ACH)ELISA试剂盒
Human acetylcholine,ACH ELISA KIT
用途
本试剂盒仅供科研使用，定量检测细胞液、体液、组织、血清、血浆等标本中人乙酰胆碱（ACH）的含量。
原理:
采用双抗体夹心法测定人乙酰胆碱（ACH）水平。用纯化的人乙酰胆碱（ACH）抗体包被微孔板，制成固相载体，实验时依次在微孔板中加入样本及标准品，并加入HRP标记的ACH抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，反复洗涤后加底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，再用硫酸终止反应，转变成黄色。颜色的深浅和样品中的ACH含量呈正相关。采用酶标仪在450nm波长测定吸光度（OD值），根据标准曲线，计算测试样品中ACH浓度。
试剂盒组成
| 序号 | 名称 | 规格 |
| 1 | 酶标包被板 | 96孔*1可拆卸板 |
| 2 | 酶标试剂 | 6ml*1瓶 |
| 3 | 标准品(浓度2000 pg/ml) | 0.6ml*1瓶 |
| 4 | 标准品稀释液 | 2ml*1瓶 |
| 5 | 生物素标记的抗ACH抗体 | 1.5ml*1瓶 |
| 6 | 显色剂A液 | 6ml*1瓶 |
| 7 | 显色剂B液 | 6ml*1瓶 |
| 8 | 终止液 | 6ml*1瓶 |
| 9 | 浓缩洗涤液（*30） | 20ml*1瓶 |
| 10 | 封板膜 | 1张 |
| 11 | 使用说明书 | 1份 |
实验材料与试剂配制：
1. 仪器与材料：酶标仪（使用前预热30分钟），微量加液器、吸头、蒸馏水或去离子水，滤纸。
2. 洗液的配制：按1:30的比例配制洗液备用。
样品收集、处理及保存
1. 细胞培养上清：适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。用无菌管收集细胞上清液，以1000×g离心15分钟，收集上清。
2. 细胞：用PBS反复洗涤细胞3次，调整细胞浓度达到104-106/ml 左右，通过反复冻融，使细胞破坏并放出细胞内成份，或者细胞超声粉碎，离心取上清液检测。
3. 血清：在室温下，血液自然凝固，以1000×g离心15分钟，取上清待测。
4. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合后静置10-20 分钟后，以1000×g离心15分钟，收集上清。
5. 体液：包括胸腹水、脑脊液，分泌物等。使用不含热原和内毒素的离心管收集，以1000×g离心15分钟，收集上清。
6. 组织标本：切取组织标本，称取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或匀浆器，或超声破碎仪将标本匀浆，以2000-3000 rmp离心20 分钟，收集上清进行检测。
7. 样品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
8. 保存：如果样品不能立即检测，应将其分装，-70 ℃保存，避免反复冷冻。保存过程中如出现沉淀，应再次离心。血液标本尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
操作步骤：
1. 取出试剂盒，室温（20-25℃）放置30分钟。
2. 分组：取出96孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。分别设标准品组（6个浓度）、空白孔、待测样品组。
标准品的稀释：准备小试管6 只，依次编好号码，先在各小试管中加入标准品稀释液100ul，然后取原浓度标准品100ul加入一只已编好号的试管中，充分混匀;再在该试管中取100ul 加入第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第三只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第四只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第五只试管中，充分混匀；然后在该试管中取100ul，弃掉。第六只试管作为0 号标准品。稀释后各管浓度分别是：1000 pg/ml,500 pg/ml,250 pg/ml, pg/ml,125pg/ml,62.5pg/ml,0 pg/ml。
注：为减少实验误差，保证准确性，建议设置复孔。
3. 加样：依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入50ul的蒸馏水；其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗ACH 抗体10ul。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。
6. 加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液（空白对照孔除外）。
7. 温育：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于37℃恒温孵育1小时。
8. 洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置15-30s，充分清洗酶标板5次，用吸水纸彻底拍干。
9. 显色：各孔加入显色剂A液50ul后，再加入显色剂B液50ul。
10. 终止：25-37℃下避光反应10-15分钟，加入50ul终止液。
11. 读板：在450nm波长读取各孔的OD值。
注：读板时必须拭干板底残留的液体和手指痕迹，读板时间控制在终止反应后的30分钟内，以免影响准确性。
数据计算
1. 绘制标准曲线：各标准品OD值减去底色即减去空白孔OD值，以6个标准品的OD值为纵坐标y，以标准品的浓度为横坐标x，绘制曲线图，如图示，并计算出回归方程y=ax+b。
2. 将待测样品的OD值代入方程式，计算各组样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际ACH浓度。
3. 敏感度：1.0 pg/ml
注意事项：
1. 实验操作中必须使用一次性吸头，避免交叉污染。
2. 加样：加样时，要控制加样速度，避免孔与*后一孔间的时间间隔过大，否则将会导致不同的预孵育时间，从而影响实验的准确性以及重复性。
3. 孵育：严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行。
4. 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化，如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。
5. 建议实验前预测样品含量，如样品浓度过高，应对样品进行稀释，计算结果时乘以相应的稀释倍数。
6. 建议使用本试剂盒时先做预实验（即先做标准曲线，试用几个标本），如果对本试剂盒有任何疑问，可和所购经销商联系，如果因运输过程导致试剂盒失效，可要求调换，但概不承担产品本身以外的任何损失。
安全性
1． 避免人体直接接触显色剂A、B和终止液。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2． 实验中不要进食、抽烟或使用化妆品。
3． 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
保存条件及有效期：
1.试剂盒保存：2-8℃
2.有效期：6个月
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