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血浆凝血酶调节蛋白抗原检测
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上传时间：2015/4/22 10:24:48
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上 传 者：恒远免疫学第三方检测中心
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血浆凝血酶调节蛋白抗原检测
实验原理
以抗人血栓调节蛋白单克隆抗体（或抗血清）包被聚苯乙烯放免小杯，样品中的TM结合于包被的放免小杯上，加入125I-抗人TM单抗，根据结合的125I-放射性强度计算出样品中TM含量。
主要试剂与器材
1、抗人TM单克隆（或多克隆）抗体包被液：将抗人TM单抗用0.1mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.5）稀释至10μg/ml。
2、缓冲液A：0.05mol/L Tris-HCI，0.15mol/L NaCl，2.5mol/LCaCl2，肝素20U/ml，pH7.4。
3、缓冲液B：0.05mol/L Tris-HCI，0.15mol/L NaCl，2.5mol/LCaCl2，5mg/mL BSA，pH7.4。
4、人TM标准液：取人TM标准品用缓冲液A稀释至500ng/mL。
5、125I-抗人TM单抗：取125I-抗人TM单抗用缓冲液B稀释至终浓度105cpm/0.2ml。
6、洗涤液A：0.05mol/L Tris-HCI，0.15mol/L NaCl，2.5mol/LCaCl2，pH7.4。
7、洗涤液B：洗涤液A含0.05% Tween 20。
操作步骤
1、样品采集：全血9份2%EDTA-Na2 1份（或3.8%枸橼酸钠1份）抗凝，1500rpm离心10min，以分离血浆。血管内皮细胞样品，收集细胞培养上清液或细胞溶解物上清液。尿液检测取24h尿或早晨次尿液。
2、将200μl抗人TM单抗包被液加入聚苯乙烯放免小杯，4℃过夜，用洗涤液A洗3次。将待测样品（或TM标准液）0.25ml与等量缓冲液A混合，每小杯加入200μl稀释样品液（空白管加入200μl缓冲液A），37℃水浴2h，用洗涤液A洗3次，加入200μl125I-抗人TM单抗，37℃水浴2h，再用洗涤液B洗6次，γ计算仪测放射活性。
3、结果结算：1.以正常人混合血浆（或尿液）TM含量为100%，计算待测样品TM：Ag百分率。2.标准曲线的制备：人TM标准品用缓冲液A作倍比稀释，TM浓度分别为500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.6ng/mL、7.8ng/mL、3.9ng/mL、和0ng/mL，然后同上述方法测TM含量，以人TM浓度为横坐标，以每分钟的放射性脉冲数为纵坐标绘制标准曲线，或计算出直线回归方程。
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