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限制性内切酶质量控制(Restriction Endonucleases: Quality Control)
点击次数：638 发布时间：2013/5/19 9:55:01
单位定义
限制性内切酶的一个活性单位是指，在50μl 的反应体系里，采用随酶提供的 NEBuffer，用1个小时的时间，彻底消化1μg底物DNA所需要的酶量。酶切反应应在带盖的Eppendorf 管中进行，选用技术数据卡上所标明的适宜温度。在确定酶活性之前，浓缩的酶应该用推荐的贮存液稀释成大约1,000 单位/ml。
质量控制
所有质量控制鉴定结果都公布在随酶提供的技术数据卡上。
非特异性内切酶鉴定
为鉴定非特异性内切酶污染，限制性内切酶与缺少该酶识别序列的超螺旋DNA底物温育。对于RF I型DNA（超螺旋形式），一个单一的非特异性缺口就会将它转变成RF II型DNA（带缺口环状）。小份的限制性内切酶与1μgDNA在50μl反应体系中，采用推荐的NEBuffer，在推荐的温度下温育4小时。两种形式的DNA在琼脂糖凝胶上很容易区分，可以计算出从RF I 到 RF II的转化率。
核酸酶污染的过夜鉴定
所有的限制性内切酶与1μg 底物DNA在50μl反应体系中，采用推荐的NEBuffer温育过夜。比较酶切1小时的特征带型和过夜酶切的带型。如果两种情况下带型均明显、没有改变，则说明测试的酶中不存在非特异性的DNA酶。我们报道了可以温育过夜的酶单位数。
核酸外切酶污染鉴定
所有的限制性内切酶与1μg 单双链混合的、3H标记的E.coli DNA （200,000 cpm/μg）在50μl反应体系中，采用随酶提供的NEBuffer，在推荐的温度下温育4小时。通过可溶解的TCA着色，可以计算出反应体系中被标记的DNA的百分比，进而可以显示出核酸外切酶的污染。该种方法可检测出的底线是0.05%。
DNA片段的连接
DNA片段通过用每一种限制性内切酶过量消化底物DNA而获得。这些片段随后用T4 DNA连接酶连接（ 5′ 末端浓度为0.1-1.0 μM）。连接的片段然后用同一种限制性内切酶重切。仅当3′ 和 5′末端都保留完整，连接反应才会发生；而且只有那些识别位点完全恢复的分子才能被重切。切割后正常的带型说明3′ 和 5′末端都是完整的，而且准备的酶样品中检测不到核酸外切酶和磷酸酶。采用PstI的一个例子显示如下：
蓝白斑筛选鉴定
用于克隆的酶还须通过额外的质量鉴定――蓝白斑筛选鉴定，以确定经酶过量消化后DNA末端的完整性。该种鉴定方法为：用酶10倍过量消化适当的载体上lacZ基因中单一的酶切位点，连接，转化，并涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、连接和表达b-galactosidase可以说明克隆后基因是完整的，一个完整的基因产生蓝斑，一个不完整的基因（例如，降解的DNA末端）产生白斑。在进行蓝白斑鉴定中，所有的限制性内切酶产生的白斑数量不应超过3%。
原创作者：上海顺元生物科技有限公司
