本植物RNA提取试剂盒，其原理完全不同于异硫氰酸胍/酚/氯仿提取方法，克服了后者不能区分RNA （本质上是多糖）和其他植物多糖的缺点，能高效将RNA和其他植物多糖分开，同时还能有效去除多酚和其他植物次级代谢成份。其有效性在近五十多种各类植物（见附录，包括十分棘手的松柏类植物）中得到验证。

1.         适用于绝大多数植物，从五十多种植物材料中都成功提取到了总RNA，其中包括松针、柏树、香蕉等用胍/酚/氯仿方法未能提取到RNA的植物（注：部分植物组织，如果实， RNase含量极高, 需要另外加RVC抑制其活性）。

2.         操作简单快速，*短可以只需要约十五分钟，可以全在室温下进行。

3.                    得到的RNA平均 OD260/280在1.9左右，可直接用于RT-PCR和Northern等研究。

成份	50 次（3080-50）	250 次（3080-250）
溶液A	50 mL	250 mL
溶液B	15 mL	75 mL
溶液C	25 mL	125 mL
溶液D	25 mL	125 mL
使用手册	1份	1份

常温运输，4℃保存，有效期一年。

氯仿、75%乙醇、RNA溶解液。

a）     估算试剂和组织细胞的用量并准备足够的氯仿、75%乙醇和RNA溶解液（如RNASAVER、无RNase的水或有灭活残留RNase活性的液相RNase清除剂）。每次微量提取一般需要100-200 mg植物叶片、或50-100 mg植物种子、或200-500 mg植物果实。

b）            溶解溶液A沉淀。溶液A在4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在65℃水浴使沉淀彻底溶解。

a）   先将新鲜植物组织剪切成小块（保存在RNALOCKER中的植物组织需用纸吸去RNALOCKER液体后再剪切成小块），放入10-15 mL塑料离心管中，加入1 mL溶液A，然后用匀浆器匀浆5-20秒，将不超过1 mL的匀浆液转移至干净的1.5 mL塑料离心管中（可以不必转移非液体的细胞碎片）。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。有的植物组织（果实）含有大量水份，匀浆液会多于1 mL，转移时也只取1 mL。

b）   如果用砚磨法破碎植物组织，需将植物组织浸泡在1 mL溶液A中再砚磨，尽量避免植物组织跟空气直接接触，然后将砚磨物转移到新的1.5 mL离心管中。

a）     在装有裂解物的离心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自备氯仿，用手上下颠倒或振荡器振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。

b）     室温12000-15000 g离心5分钟，两相间将有约5-10毫米厚的细胞破碎物。

c）            将上清液（约0.8 mL）转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。留下100 μL上清液不取。

a）   在上清液中加入0.5 mL的溶液C和0.2 mL的自备氯仿，用手上下颠倒或振荡器振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。

b）   室温12000-15000 g离心3分钟，两相间将有白色膜状物（蛋白质）形成。

c）        将上清液（约1 mL）转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中,避免触及或吸取有机相及其上面的白色膜状物。

a）     在上清液中加入0.5倍体积的溶液D，用手上下颠倒或振荡器振荡30秒混匀，此时溶液呈白色浑浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。如果提取 50 mg以下的微量植物组织样品，在此步加入天恩泽的微量助沉剂RNADOWN。

b）     室温12000-15000 g离心3-5分钟，RNA将在管底形成白色沉淀（约黄豆大小）。如果组织样品量少或需要提高RNA回收率，也可以延长离心时间到20-30分钟。

c）            小心移弃上清液，避免触及管底RNA沉淀。

注意：如果加入溶液D离心后沉淀漂浮在上面，说明植物糖份多，溶液比重大，可以少加植物样品，也可以适当加无RNase的水稀释直到沉淀能够沉下去为止。如果离心后管底有类似氯仿的相出现，说明上一步离心时间不够或取上清时取到了下层的有机相，可以适当延长离心时间或取上清时留下约100 μL不取或在第四步时加0.3 mL的自备氯仿。

a）     在离心管中加入1mL 75%的乙醇，振荡器上振荡混均30秒。

b）     室温12000-15000 g离心1分钟，RNA将在管底形成细小沉淀（约芝麻大小）。

c）            小心吸弃上清液,注意不要吸弃RNA沉淀。

a）     重复第六步一次。

b）            短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留液,注意不要吸弃沉淀。此步将有效去除残留的乙醇，否则后续反应会受到影响。

a）            加入适量（一般为20-100 μL） RNA溶解液使RNA沉淀溶解，存放于-80℃或立即使用。千万不要用真空离心法使RNA沉淀过于干燥,否则RNA将变得十分难溶。

a）     RNA完整性的电泳检测

如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是简单检测，可以使用TAE或天恩泽的SuperBuffer-2 DNA/RNA两用快速电泳液，但文献报道必须使用变性上样液（BioTechniques，9：558，1990）。普通DNA上样液不含变性剂，也没经过去RNase处理，所以不要使用。

尤其需要注意的是不要使用TBE进行RNA电泳，因为TBE所含硼酸是研究多糖的经典方法－－－－硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与RNA核糖中的羟基发生络合反应，形成RNA分子内或RNA分子间的络合复合物，使同样长度的RNA具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有大的RNA络合复合物迟留在加样孔中（一般会误以为是基因组DNA污染）。RNA分子内或RNA分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸与RNA的数量比例有关，而RNA样品中污染的其他多糖（如植物中提取的RNA）也会参与此反应，使硼酸对RNA电泳的影响更复杂，所以TBE对RNA电泳的影响没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，是避免使用。

由于动物细胞中70-80%的RNA为rRNA，后者又由28S （约4800 nt），18S （约1900 nt）和5.8S （约120 nt）三种组成，所以变性胶电泳后应该在UV下看见三条清晰的rRNA带。由于核酸长度与结合EB的数量成正比（当然还与RNA的二级结构有关，双链部分结合能力比单链部分强），所以28S rRNA条带的荧光强度一般比18S rRNA条带的荧光强度强1.5-2.3倍。如果这两条rRNA带不清晰或比例小于此范围则表示RNA有降解（因为大的RNA被酶降解的可能更大）。

跟动物一样，植物果实和种子的RNA一般有三条电泳带，但植物叶片的RNA有四条或更多rRNA带，多余的RNA来源于叶片中大量存在的叶绿体。

b）     RNA产量产率测定

将5-10 μL RNA溶于TE缓冲液中（pH7.5-8.2之间）检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA的产量（浓度X体积）和产率（RNA产量/组织用量）。

注意不要将RNA稀释在DEPC水中检测OD260和OD280，否则光吸收比在TE中测得的低10%-15%，因为核酸光吸收跟溶液pH相关，而DEPC水中的DEPC高压分解后产生的CO₂ 与水反应生成碳酸，使溶液pH降低进而降低RNA的光吸收。RNA的产率还随组织的营养状态和组织的种类不同而不同，100 mg种子的RNA产量一般为100-120 μg，100 mg叶片为30-60 μg, 100 mg果实为20-40 μg。

c）     RNA纯度测定

无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之间（具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关），OD260/OD230一般在2.0-2.3之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响RT-PCR等反应。蛋白质污染可以通过酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA和多糖污染可以分别用天恩泽的DNA Erasol 和PS Erasol去除。

因素	说明	对策
多酚	多存在于植物果实和针叶植物中。匀浆时释放出来，氧化成醌（多为褐色）后能与RNA共价结合，使RNA在提取过程中进入酚相而丢失。	还原法；螯合法；硼砂法；沉淀法；丙酮法；低pH法。
多糖	广泛存在于何种组织。其多羟基特点与RNA相似。能去除的多糖会裹走部分RNA而降低其产量；不能去除的多糖与RNA共沉淀，使溶液粘稠，同时还会抑制后续的RT等酶反应。	高盐沉淀法；低醇沉淀法；CsCl梯度离心法等
蛋白质	包括植物特有的RNase和多酚氧化酶。	Proteinase K降解法；抑制剂法；高氯酸钠沉淀法；变性灭活法。
次级代谢物	多存在于高等植物成熟组织中，成分复杂，水溶。能与RNA共沉淀，抑制后续的酶反应。	CsCl梯度离心法
来源于植物组织RNA提取难点及对策（生物技术通讯，1999。李宏等）。

Q：上样孔里的红色荧光物一定是污染的基因组DNA吗？

A：不是。用TAE或TBE电泳液和非变性胶电泳RNA时容易产生此现象，天恩泽初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA通过碱基互补或通过硼酸络合（如果使用TBE作电泳液的话）形成的复合物，加RNase处理后，这些红色荧光物一般会消失。为避免此现象，建议使用甲醛变性胶电泳。如果需要使用非变性胶，也必须在上样前使RNA变性。使用天恩泽优化的上样/变性/染色三用溶液RNAON可以使RNA在非变性胶上电泳时也有较好分辨率。使用非变性胶时，可以使用TAE或超快电泳液SuperBuffer-2,不要使用TBE缓冲液，因为TBE中的硼酸能与RNA的多羟基形成复合物，RNA很难形成锐利的条带。

Q：如何确认和去处除污染的基因组DNA？

A：如果怀疑有DNA污染，可以用RNase处理RNA样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组DNA污染。进一步确认可以使用PCR扩增法。去除污染的DNA可以使用非酶的DNA去除剂DNA Erasol或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase一般都有残留的RNase污染，所以必须严格按照厂家提供的使用手册进行操作。

Q：为何提取的RNA电泳时带型不清楚或根本没有条带？

A：可能原因：1、电泳没有使用MOPS缓冲液+甲醛变性胶；2、没有使用RNA专用的上样液或使用的RNA专用的上样液放置时间过长；3、植物组织样品中RNase很多，可以使用RVC（部分植物果实需要此处理）；4、植物组织中含多酚等影响提取的物质（如松柏等植物），可以在溶液A中加入终浓度为0.1 M的硼氢化钠。

1.       王玮等，CHS ａnd UBGAT Expression ａnd Baicalin Accumulation in the Roots of Scutellaria baicalensis Georgi during Cultivation Seasons，     Journal of Fudan University （Natural Science），vol.45，2006，P.674-678。