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PITC为柱前衍生试剂的氨基酸分析
摘要：
采用异硫氰酸苯酯（PITC）为柱前衍生试剂进行氨基酸衍生，二元流动相程序洗脱方法分离17种常见氨基酸，分离效果好，无需柱后反应装置，反应速度快，保留时间重现性好。
实验部分：
仪器与试剂：
Labtech LC600高效液相色谱仪；Labtech 氨基酸色谱柱（5um, 250×4.6mm）；17种氨基酸标样；乙腈（色谱纯）；水（超纯水）；醋酸钠（分析纯）；醋酸（分析纯）；三乙胺；异硫氰酸苯酯。
色谱条件：
流动相A：乙腈/B＝1/1（V：V），流动相B：50mmolNaAC缓冲溶液（PH=6.5）流速：1ml/min，进样1uL（自动进样方式），检测波长：254nm，柱温为40℃。
梯度程序：
Time （min） | Mobile phase A （V/V） | Mobile phase B （V/V） |
0 | 10 | 90 |
5 | 10 | 90 |
20 | 30 | 70 |
45 | 60 | 40 |
50 | 95 | 5 |
55 | 95 | 5 |
55:10 | 10 | 90 |
75 | 10 | 90 |
柱前衍生步骤：
1. 17种氨基酸混合标准溶液：分别称取适量天门东氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、胱氨酸于容量瓶中，以0.1N盐酸定容，得到2.5mmol/L混合标准贮备液（其中胱氨酸1.25mmol/L）。
2. 1mol/L三乙胺乙腈溶液：取三乙胺139ul，加乙腈860ul。
3. 1mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液：取12ulPITC加乙腈988ul。
4. 对照品溶液的衍生：取氨基酸溶液800ul置离心管中，加1mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液400ul，1mol/L三乙胺乙腈溶液400ul，混匀，室温放置1小时，加入正己烷1.6ml，放置10分钟，取下层溶液进样。
结果与讨论：
取衍生好的氨基酸标准溶液样品，连续测定10次，因次进样系统未完全平衡好，保留时间有漂移，*后一次进样由于室内温度较高，考虑到样品放置时间长可能会对峰面积有影响，故舍去与*后一次进样，统计8次进样结果和重叠色谱图如下，
氨基酸重复性结果（n＝8）
Amino Acid
| Retention time | Area |
RSD% | RSD% | |
Asp | 0.31 | 6.97 |
Glu | 0.25 | 7.19 |
Ser | 0.15 | 7.08 |
Gly | 0.12 | 6.59 |
His | 0.11 | 6.50 |
Arg | 0.11 | 6.97 |
Thr | 0.11 | 6.26 |
Ala | 0.13 | 7.29 |
Pro | 0.11 | 6.70 |
Tyr | 0.11 | 6.81 |
Val | 0.15 | 6.69 |
Met | 0.15 | 6.75 |
Cys-Cys | 0.19 | 17.04 |
Lle | 0.19 | 6.73 |
Leu | 0.20 | 6.90 |
Phe | 0.17 | 6.62 |
Lys | 0.15 | 8.90 |
8次重复进样色谱图
从数据可得知保留时间有较好的重现性，RSD0.31%，由于进样1ul，进样量较小，所以峰面积的RSD稍大，在实际测定工作当中可以加大进样量和添加内标的方式改善。
原创作者：莱伯泰科有限公司
