对于ELISA实验中的“显色和比色”您了解多少呢？

显色和比色

TMB 经HRP 作用后，约40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 小时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠dan钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。

酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA 结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30 分钟，测读结果更稳定。测读A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波长。

有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，次在*适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不 移动ELISA 板的位置，*终测得的A 值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

(一) 显色

　　显色是ELISA中的后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。

　　适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显se情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。

　　OPD底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。

　　TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。

　　TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24小时)不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。

　　(二)比色

　　比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。

　　在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。 比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔(未经任何反应仅加底物液的孔)和空白孔(以盐水或稀释液代替标本作全过程的孔)，以记录本次试验的试剂状况。

　　其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。

　　比色结果的表达以往通用光密度(oplical density，OD)，现按规定用吸光度(absorbence，A)，两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。


对于ELISA实验中的“显色和比色”您了解多少呢？

原创作者：上海信帆生物科技有限公司