机体免疫应答过程的复杂性和严格的调控性，是由多种免疫细胞和免疫分子共同参与而完成的。而免疫应答的核心是T淋巴细胞的活化。

       研究表明，诱导T淋巴细胞活化、增殖及分化为效应细胞需要双信号刺激：信号来自抗原由TCR转导并由粘附分子增强；第二信号即协同刺激信号由APCs表面的协同刺激分子和T细胞的相应受体相互作用后产生。协同刺激分子主要分为免疫球蛋白超家族、TNF／TNFR超家族及细胞因子超家族三种。B7／CD28属于免疫球蛋白超家族，其提供的第二信号，是迄今为止公认的*基本的协同刺激信号。B7家族分子属于免疫球蛋白超家族，其成员主要有B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、B7-H1（PD-（?）1）、B7-DC（PD-L2）、B7-H2（GL50）和B7-H3等，主要表达于树突状细胞、单核细胞、朗格汉斯细胞、巨噬细胞和B细胞等抗原递呈细胞（APC）表面。

       但近年来的研究证实，部分B7家族分子还表达于关节炎病人的关节腔T细胞、系统性红斑狼疮患者的外周血T细胞、DC与T细胞共培养一段时间后的T细胞表面。CD28分子为Mr．44KD的同源二聚体组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白。1980年首先由Hansen等用单克隆抗体发现，随后将人的CD28分子基因克隆并表达，主要表达于9596的CD4~+T细胞和50％的CD8~+T细胞、活化的T细胞、成熟胸腺细胞和部分NK细胞等。与其天然配体CD80／CD86分子结合形成的协同刺激信号，在免疫应答的早期发挥重要作用。其在降低T细胞活化阈值、调节细胞迁移和Th1／Th2分化、诱导抗凋亡基因Bcl-XL表达、增加细胞因子IL-2的分泌、促进免疫突触形成及阻止T细胞失能等方面均具有重要作用。对该信号进行选择性调控，可促使机体对肿瘤的排斥和肿瘤细胞的杀伤，有助于自身免疫性疾病或超敏反应及异体器官移植排斥的防治。另外，可溶性CD28分子在免疫应答和免疫调节中发挥何种作用，在肿瘤、免疫缺陷病、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的发生、发展、转归中又 鼠抗人CD28分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学的特性的鉴定 中文摘要 有何意义，目前仍不清楚。

    因此，CD28功能性单克隆抗体的研制及可溶性CD28分子 检测方法的建立，为CD28及相关协同刺激分子的:基础研究和肿瘤、移植排斥反应、 自身免疫性疾病等临床应用研究提供重要手段。 1.CO28单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究 1 .1杂交瘤细胞的建株及亚类鉴定 以天然高表达CD28分子的人多发性骨髓瘤细胞株U266作为免疫原，经丝裂霉 素（MMC）处理（50 pg/1 X10，细胞）后，免疫BALB/C小鼠，分颈部、皮下多点及腹 腔注射。采用B淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫后的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞 SPZ/0进行融合。以小鼠恶性淋巴瘤细胞转人CD28基因细胞株CD28一T作为筛选细胞 株，同时以转基因细胞的母本细胞及不表达CD28分子的OaUdi细胞作为阴性对照细 胞株，经HAT培养、间接免疫荧光分析和多次的克隆化培养及反复筛选，在融合的 72块96孔板中，*终获得5株持续、稳定分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细 胞株，分别命名为2D5、2F5、3B6、3F8和8G8。经快速定性试纸分析法鉴定，5株 单抗中的2D5属小鼠IgGZa亚类，其余均为工gGI，正类。经体外连续传代培养，液氮 冻存半年以上，复苏后仍生长良好，分泌抗体的忆有旨稳定。 1.2单克隆抗体的制备、纯化及效价测定 采用本室建立的体内腹水诱生法制备单克隆抗体。将生长良好的杂交瘤细胞注入 经Pri stane预致敏的BALB/C小鼠腹腔。5~10天后收获腹水，离心后收集含有单抗 的上清。小鼠腹水阳性形成率为900k以上，腹水收获量平均为7.4ml/只，个别小鼠达 25ml/只以上。经ProteinG亲和层析法纯化抗休，抗体蛋白含量在1.2一4.7mg/m1 腹水之间。将腹水型单抗、杂交瘤培养上清和纯化后mAb用PBS梯度稀释后，与U266 细胞反应，间接免疫荧光法分析，以出现同样阳性率的稀释倍数或*小蛋白浓度 为抗体的效价。结果表明，培养上清中单抗效价为l:200以上，腹水型单抗效价为l: 2000以上，纯化的抗体蛋白用于间接免疫荧光分析的用量为0.5 pg/5 x IJ细胞。 1.3单抗识别的抗原位点及对不同细胞株膜型CO28分子的识别 采用竞争抑制结合试验，2D5和8G8能完全阻折阳性对照直标单抗CD28一FITC与 U266细胞的结合，表明2D5和8G8与阳性对照单伉识别相同或相似的抗原位点;其 鼠抗人CD28分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学的特性的鉴定中文摘要 余3株能部分阻断对照单抗与U266的结合，提示该3株单抗与阳性对照单抗识别不 同或不完全相同的抗原位点。 将生长良好、高表达CD28分子的人多发性骨髓瘤细胞株U266和XGI、新鲜分离 的外周血单个核细胞（PBMC）、T恶性淋巴瘤细胞株J盯kat和转基因细胞CD28一T分 别与抗体反应，通过间接免疫荧光法和流式细胞仪（FCM）分析，结果显示，5株单 抗均能良好地识别表达在不同细胞上的CD28分子， 1 .4单抗对pB丁C的激发效应及活化T细胞的表型分析 采用CD28单抗联合激发型CD3单抗激发PBT〔（通过Fic011密度梯度法和磁珠 阴性选择去除CD19、CD56阳性细胞即B细胞和NK!扭胞后获得）。鼠抗人CD3单抗（0、5 pg/ml）包被96孔板，100 pl/孔，吸去包被液，PBS洗涤2遍。

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