红霉素类药物是一类重要的β-内酰胺类抗生素，因其高效、低毒是目前兽医学临床上应用*受青睐的药物。由于该类药物的广泛使用，使其在动物源性食品上的残留现象越来越严重，虽然红霉素类药物本身对机体没有很强毒性，但容易引起药物过敏反应，是各类过敏药物之*；同时，若长期食用低浓度该类抗生素，会使细菌产生耐药性，菌群失调，导致人体免疫力降低；此外，还给动物源性食品生产加工带来不可估计的损失。

因此，建立针对青霉素类药物残留的快检测方法，开发价格适中的试剂盒产品对控制动物源性食品卫生质量、保障消费者健康、保证工业生产等具有重要的社会经济意义。本研究对青霉素类药物人工抗原的合成，动物免疫以及ELISA检测方法的建立等进行了研究，得出如下研究结果： 选用半抗原氨苄青霉素、青霉素G与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)通过生理学法和戊二醛法合成3种免疫抗原，经紫外、红外扫描和蛋白电泳实验证明半抗原与载体蛋白偶联成功，继而用相同方法与载体蛋白卵白蛋白(OVA)合成了3种包被抗原。 用合成的3种免疫抗原免疫9只新西兰大白兔，在6次加强免疫后有8只兔子产生高效价多抗血清；通过3种包被抗原进行多抗血清检测，比较了各血清的效价和亲和性，发现此两种合成方法免疫兔子均能产生青霉素类药物核特异性抗体，在本实验中生理学法合成的免疫抗原免疫效果优于戊二醛法合成法合成的，而同为生理学法合成的免疫抗原中，以氨苄青霉素为半抗原的免疫抗原效果略优于青霉素G的；并且选出多抗血清具有效价高、亲和性好、核特异性的免疫兔子脾脏，用液氮妥善保存，提供给合作单位以便与其共同制备单克隆抗体。

在前面实验结果的基础上，从合作单位获得与本实验相符，通过生理学法免疫制备获得的鼠单克隆抗体；同时，选择相应的包被抗原通过改良的过碘酸钠法与辣根过氧化物酶反应，用硫酸铵沉淀法纯化，成功制备并获得酶标抗原。利用鼠单抗、包被抗原、酶标二抗和鼠单抗、酶标抗原分别建立间接竞争ELISA检测方法和直接竞争ELISA检测方法；并对竞争性半抗原进行选择性开环处理，以提高鼠单抗的亲和性；比较上述两种ELISA检测方法的灵敏度、线性范围、线性拟合以及检测步骤、检测时间等因素，发现直接竞争ELISA法灵敏度与间接竞争ELISA法相当，而直接ELISA法检测更为简便，较适合作为试剂盒产品的检测方法。

本研究对直接ELLSA方法中的各检测条件通过单因素显著性分析和正交实验进行了比较，并确定底物溶液配方为10mLBuffer+450μLTMB+2μLH2O2，封闭液为5％甘氨酸，鼠单抗和酶标抗原使用浓度分别为稀释800倍和稀释80倍，鼠单抗包被条件为直接4℃冰箱放置过夜，封闭条件为37℃孵育2.5h，反应条件为37℃孵育1.0h，显色条件为37℃反应10min，此时可达*佳显色效果。用优化后的直接竞争ELISA检测方法测得青霉素类药物检测限，其中氨苄青霉素1.58ng/mL，青霉素G0.38ng/mL，阿莫西林1.90ng/mL，氯唑西林0.13ng/mL，苯唑西林0.44ng/mL，均能达到食品中各青霉素类药物残留检测标准。 整个试剂盒实际检测操作时间在1.5h以内；以青霉素G为对照物，通过多次重复实验，取平均值，给出缓冲溶液条件下推荐的标准曲线，曲线方程为Y=0.327X+0.2419，X为log(青霉素浓度ng/mL)，Y为抑制率，检测限0.368ng/mL，检测范围0.5～100ng/mL，尿样和牛奶样品稀释10倍后检测可参照此标准曲线，检测样品回收率在70～120％之间。由于青霉素类药物在奶制品中残留的严重现象，针对牛奶特殊样品，用10％脱脂奶粉溶液做牛奶基质，得到以牛奶为基质时的较理想标准曲线，曲线方程为Y=0.3288X+0.1666，X为log(青霉素浓度ng/mL)，Y为抑制率，检测限0.627ng/mL，检测范围1.0～100ng/mL，牛奶样品原浓度检测可参照此标准曲线，检测样品回收率在70～120％之间。

原创作者：上海信帆生物科技有限公司