染色质免疫共沉淀技术（ChIP）] 实验原理 基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的 蛋白结合的 DN段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。CHIP 不仅可以检测体内反式因子与 DNA 的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP 与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CH [ChIP 染色质 免疫共沉淀 细胞蛋白质 抗体]

实验原理

基 本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋 白结合的 DN段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。CHIP 不仅可以检测体内反式因子与 DNA 的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP 与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP 与基因芯片相结合建立的CHIP-on- chip 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP 用于研究 RNA 在基因表达调控中的作用。由此可见，随着 CHIP 的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

实验试剂

1. 37% 甲醛
2. 甘氨酸
3. PBS
4. 蛋白酶抑制剂 （protease inhibitor）
5. RnaseA
6. 0.5MEDTA
7. 1MTris.HCl（PH6.5）
8. 10 mg/ml 蛋白酶 K 等。

实验设备

1. 10 cm 平皿
2. 水浴锅
3. 细胞刮刀
4. 超声破碎仪
5. 15 ml 离心管
6. 高速离心机
7. 交联仪等。

实验材料

培养好的细胞

实验步骤

1. 细胞的甲醛交联与超声破碎 （天）
1） 取出 1 平皿细胞（10 cm 平皿），加入 243 ul 37% 甲醛，使得甲醛的终浓度为 1%（培养基共有 9 ml）。
2） 37 摄氏度孵育 10 min.
3） 终止交联：加甘氨酸至终浓度为 0.125M.450 ul 2.5M 甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置 5 min 即可。
4） 吸尽培养基，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 次。
5） 细胞刮刀收集细胞于 15 ml 离心管中（PBS 依次为 5 ml,3 ml 和 3 ml）。预冷后 2000rpm 5 min 收集细胞。
6） 倒去上清。按照细胞量，加入 SDS Lysis Buffer.使得细胞终浓度为每 200ul 含 2×106 个细胞。这样每 100ul溶液含 1×106 个细胞。再加入蛋白酶抑制剂 （protease inhibitor） 复合物。假设 MCF7 长满板为 5×106个细胞。本次细胞长得约为 80%.即为 4×106 个细胞。因此每管加入 400ul  Lysis Buffer.将 2 管混在一起，共 800ul.
7） 超声破碎：VCX750,25% 功率，4.5S 冲击，9S 间隙。共 14 次。

2. 除杂及抗体哺育 （天）
1） 超声破碎结束后，10,000 g 4 度离心 10 min.去除不溶物质。留取 300ul 做实验，其余保存于-80 度。300ul中，100ul 加抗体做为实验组；100ul 不加抗体做为对照组；100ul 加入 4ul5MNaCl（NaCl 终浓度为 0.2M），65度处理 3 h 解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
2） 在 100ul 的超声破碎产物中，加入 900ulChIPDilutionBuffer 和 20ul 的 50×PIC。再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA.4 度颠转混匀 1 h.
3） 1 h 后，在 4 摄氏度静置 10 min 沉淀，700rpm 离心 1 min.
4） 取上清。各留取 20ul 做为 input.一管中加入 1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4 度颠转过夜。

3. 检验超声破碎的效果 （天）
取 100ul 超声破碎后产物，加入 4ul5MNaCl,65 度处理 2 h 解交联。分出一半用酚/抽提。电泳检测超声效果。

4. 免疫复合物的沉淀及清洗 （第二天）
1） 孵育过夜后，每管中加入 60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA.4 度颠转 2 h.
2） 4 度静置 10 min 后，700rpm 离心 1 min.除去上清。
3） 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在 4 度颠转 10 min,4 度静置 10 min 沉淀，700rpm 离心 1 min,除去上清。

洗涤溶液：
a. 低盐溶液一次
b. 高盐溶液一次
c. LiCl 溶液一次
d. TE buffer 两次
4） 清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共 1 ml。每管加入250ul 洗脱 buffer,室温下颠转 15 min,静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。*终的洗脱液为每管 500ul.
5） 解交联：每管中加入 20ul 5M NaCl（NaCl 终浓度为 0.2M）。混匀，65 度解交联过夜。

5. DNA 样品的回收 （第三天）
1） 解交联结束后，每管加入 1ulRNaseA（MBI），37 度孵育 1 h.
2） 每管加入 10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl（PH6.5），2ul10 mg/ml 蛋白酶 K。45 度处理 2 h.
3） DNA 片段的回收-omega 胶回收试剂盒。*终的样品溶于 100ulddH2O.

6. PCR 分析 （第三天）

ChIP- chip 技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著，同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症（cancer）、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。 研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前 ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域：及转录因子的结合和条件特异性；组蛋白的修饰，组蛋白 修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip 在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是，可以在体内进行反应；在给定的检验细胞环境的模式下得到 DNA相互关系的简单影像；使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点；直接或者间接（通过蛋白质与蛋白质的相互作用）的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难于获得；为 了获得高丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之，ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中 DNA 与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中，将对芯片的构建进行改进，提高其实用性。使用易于获得抗体，增加这种方法的可用性。

原创作者：上海信帆生物科技有限公司