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技术文章
GST融合蛋白表达与纯化的实验步骤与注意事项
点击次数：17323 发布时间：2015/11/24 11:00:26
GST表达融合蛋白
载体
pGEX-KG
大小：5006bp，氨苄青霉素抗性（Ampr），iptg诱导表达
酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994
GST分子量：
构建pGEX-KG-YFG重组质粒
1、分析所感兴趣的基因（your favorite GENE, YFG）
Primer Premier 5.0软件，分析YFG含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG载体的多克隆位点有重合
2、确定合适的双酶切位点
NEB网站（www.neb.com） Double Digest Finder软件，查找*佳双酶切组合（下表）
| NEB双酶切图谱 | |||
| BamHI | EcoRI | NEBuffer EcoRI + BSA at 37°C. | BamHI may exhibit star activity in this buffer. |
| XbaI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C. | At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. | |
| NcoI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C. | ||
| SalI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C | ||
| XhoI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C. | ||
| SmaI | XbaI | NEBuffer 4 + BSA at 25°C with SmaI, then add XbaI ａnd raise temperature to 37°C. | At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. |
| NcoI | NEBuffer 4 at 25°C with SmaI, then add NcoI ａnd raise temperature to 37°C. | ||
| XhoI | NEBuffer 4 + BSA at 25°C with SmaI, then add XhoI ａnd raise temperature to 37°C. | ||
| SacI | NEBuffer 4 + BSA at 25°C with SmaI, then add SacI ａnd raise temperature to 37°C. | ||
| HindIII | NEBuffer 4 at 25°C with SmaI, then add HindIII ａnd raise temperature to 37°C. | At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. | |
| EcoRI | NcoI | NEBuffer EcoRI at 37°C. | |
| SalI | NEBuffer EcoRI + BSA at 37°C. | ||
| XhoI | NEBuffer EcoRI + BSA at 37°C. | ||
| SacI | NEBuffer 1 + BSA at 37°C. | EcoRI may exhibit star activity in this buffer. | |
| HindIII | NEBuffer EcoRI at 37°C. | ||
| XbaI | NcoI | NEBuffer 2 + BSA at 37°C. | |
| SalI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C. | At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. | |
| XhoI | NEBuffer 2 + BSA at 37°C. | ||
| SacI | NEBuffer 4 + BSA at 37°C. | This buffer is not supplied with either enzyme. At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. | |
| HindIII | NEBuffer 2 + BSA at 37°C. | ||
| NcoI | SalI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C. | |
| XhoI | NEBuffer 2 + BSA at 37°C. | ||
| SacI | NEBuffer 1 + BSA at 37°C. | ||
| HindIII | NEBuffer 2 at 37°C. | ||
| SalI | XhoI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C. | |
| XhoI | SacI | NEBuffer 1 + BSA at 37°C. | At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. |
| HindIII | NEBuffer 2 + BSA at 37°C. | ||
| SacI | HindIII | NEBuffer 2 + BSA at 37°C. | At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. |
3、设计PCR上、下游引物
Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物
酶切位点外*多含6个碱基
3’端不是A，是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾
3’端至少保证有10个碱基完全配对
得分（Rating）大于70
[注意]
上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框
下游引物：添加终止密码子（UAA、UAG、UGA）
4、引物合成及保存
合成：上海生工生物工程技术服务有限公司（Email：beijing@sangon.com，Tel：81767586）;纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳?;价格1.30/碱基
保存：贮存浓度：100pmol/μl（100μM），工作浓度：10pmol/μl（10μM），-20°C保存
5、PCR扩增YFG
模板：质粒10ng/μl 稀释少量 -20°C保存
引物：10pmol/μl（10μM） -20°C保存
Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb
反应体系（配制时置于冰上）
| 25μl反应体系 | 50μl反应体系 | |
| 模板 | 1μl | 2μl |
| 上游引物 | 1μl | 2μl |
| 下游引物 | 1μl | 2μl |
| 2×Master Mix | 12.5μl | 25μl |
| 去离子H2O | 9.5μl | 19μl |
（1） 预变性 94°C 5 min
（2） 变性 94°C 30 s
（3） 退火 待定 30 s
（4） 延伸 72°C 待定
（5） 重复2-5 25-30个循环
（6） 补平缺口 72°C 10 min
（7） 暂存 10°C
[注意]
退火温度：参考4（G+C）+2（A+T）-4（互补碱基），参考Ta Opt（Primer Premier 5.0）
延伸时间：Taq酶：1kb/min
循环数小于30，减少错配
琼脂糖电泳检测PCR产物
0.8%有效分离范围：10~0.8kb;1.0%有效分离浓度7~0.5kb
50ml TAE加入5μl EB母液（5mg/ml）
100V，30-45min
拍照或者紫外灯下切胶回收
6、构建pGEX-KG-YFG
酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG
回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收
连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng
转化铺平板：Ampr
挑单克隆：Ampr（四个菌落足够了）
鉴定：小提质粒酶切 or菌体 PCR
7、转化BL21（DE3）pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达
（1）冰上融化BL21（DE3）pLysS感受态细胞（天根）
（2）2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒（300-500ng），混匀（质粒≤感受态1/10）
（3）冰上放置30min
（4）42°C，90s
（5）冰上放置2-3min
（6）加入300μl LB（无抗生素）（相当于菌体10倍体积的LB），37°C，250rpm，1 h
（7）4000rpm，2min，弃上清，其余混匀以后涂平板（Ampr），37°C，过夜（16 h）
（8）挑单克隆菌落，5ml LB（Ampr），37°C，250rpm，过夜（16 h）
（）稀释10倍、20倍、50倍测定OD600
（）选择合适的稀释倍数，5ml菌液，37°C，250 rpm，1 h，测定OD600
（7）取100μl菌液加入5ml LB（Ampr）（50倍稀释），37°C，250rpm，过夜（16 h）
（8）取500μl菌液加入5ml LB（Ampr）（10倍稀释）（其余菌液4°C保存），测OD600
（9）37°C，250 rpm，2 h（OD600：0.6-0.8），测OD600
（10）室温放置20 min（摇床降温，30°C）
（11）取100μl作为诱导前对照，冰上放置
（12）菌液中加入IPTG，终浓度0.5-1 mM
（13）30°C，250 rpm，2 -4h（可做时间梯度），测OD600
（14）取100μl作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，加入50μl 1×SDS上样缓冲液
（15）取4ml菌液，12000rpm，离心2min，收集到2ml离心管中
（16）加入1ml GST裂解缓冲液重悬菌体
（17）超声破碎细胞：超声20s，间隔10s，共3-5次，超声强度200-300W（冰浴）
（18）超声后菌液换入一个新1.5ml离心管，4°C，12000rpm，离心5min
（19）超声后上清：取25μl上清，加入25μl 2×SDS上样缓冲液（其余上清-80°C保存）
（20）超声后沉淀：沉淀加入1ml GST裂解缓冲液重悬，取25μl，加入25μl 2×SDS上样缓冲液（其余沉淀-80°C保存）
（21）将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min
（22）8-10%SDS-PAGE，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀
（23）考马斯亮蓝染色
[注意]
（1）菌液OD值小于1即可
（2）诱导时间做一个梯度，2-6h
（3）诱导温度适当摸索，24°C、30°C
（4）IPTG浓度可做梯度，1mM
（5）超声条件可视实际情况改变，只要使细菌裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠
8、测序确认
上海生工生物工程技术服务有限公司（Tel：81767529）
测序引物：pGEX-3通用引物
测序样品：过夜菌1ml;质粒（浓度大于50ng/μl，10μl）
9、中提质粒（Promega）
10、表达纯化GST融合蛋白
（1）已经转化的菌液，或者重新转化BL21（DE3）pLysS
（2）活化：取20μl菌液加入11ml LB（Ampr）（500倍稀释），37°C，250rpm，过夜（16 h）
（3）取10ml菌液加入100ml LB（Ampr）（10倍稀释）（剩余菌液4°C保存）
（4）37°C，250 rpm，1 h 10 min-1 h 20 min，OD600 0.6-0.8（OD600小于1.0即可）
（5）取1ml菌液作为诱导前对照，冰上放置
（6）加入IPTG，终浓度1 mM
（7）30°C，250rpm，诱导适当时间（预实验确定）
（8）取1ml菌液作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，收集菌体，加入100μl 1×SDS上样缓冲液
（9）其余菌液，分为两份，倒入50ml离心管，5000rpm，离心20 min，收集细胞
（10）每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体，转移小烧杯中（无气泡）
（11）超声破碎细胞：超声3s，间隔10s，40次左右，超声强度200-300W（冰浴）
（12）将超声后菌液转移到50ml离心管中，4°C，13000rpm，离心20-30min
（13）将上清转移到1个50ml离心管中，取出50μl，加入50μl 2×SDS上样缓冲液（其余上清-80°C保存）
（14）将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液（或PBS）重悬，取出50μl，加入50μl 2×SDS上样缓冲液（其余沉淀-80°C保存）
（15）将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min
（16）8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀
（17）考马斯亮蓝染色
（18）混匀glutathione sepharose beads（4B）（mixed slurry），取200μl加入15ml离心管中（2份）
（19）加入10ml PBS，混匀，3000rpm，离心3min，弃上清
（20）加入超声后上清液，4°C轻柔摇荡60分钟（或过夜）（横放）
（21）4°C，3000rpm，离心3min
（22）10ml GST裂解缓冲液洗涤2次（冰上）
（23）10ml TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT）洗涤2次（冰上）
（24）弃上清，加入1倍柱床体积的TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油），混匀
（25）取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE
（26）-20°C保存beads
11、GST-Pull-down
（1）10cm培养皿中，未处理的细胞或者转染的细胞（3-5μg质粒转染10cm培养皿，Cos-7、293T或者其他细胞，转染24h）
（2）加入1ml 细胞裂解缓冲液，细胞铲刮下细胞（冰上）
（3）将裂解液收集到1.5ml离心管中，振荡30s，冰上放置5min，重复2-3次，充分裂解细胞
（4）4°C，12000rpm，离心15min，收集上清
（5）测定蛋白浓度，取1mg总蛋白做GST-Pull-down?
（6）留30μl作为input对照（input与Pull-down蛋白量约为1/10）
（7）其余溶液，加入20μl glutathione sepharose beads（PBS洗涤过），4°C，轻柔振荡20min
（8）12000rpm，离心3min
（9）收集上清，分为两份，一份加入1-15μg GST结合的beads，另一份加入等量 GST-融合蛋白结合的beads，4°C，轻柔振荡60min
（10）3000rpm，离心3min，回收上清
（11）1ml 细胞裂解缓冲液洗涤3次
（12）弃尽上清，加入25μl 2×SDS上样缓冲液
（13）煮沸3min，12000rpm，离心3min
（14）SDS-PAGE，上样顺序：细胞裂解液input、x、GST、x、GST-融合蛋白（x：LSB）
（15）考马斯亮蓝染色或免疫印迹
[附录]
GST裂解缓冲液（前四个组分配好之后4°C保存，DTT和蛋白酶抑制剂现用现加）
配方一
| 500ml贮存液 | 10ml工作液 | |
| 150mM NaCl | 15 ml 5M NaCl | 10ml贮存液 |
| 20mM HEPES pH7.5 | 20ml 0.5M Hepes pH7.5 | |
| 5mM MgCl2 | 10ml 1M MgCl2 | |
| 1% TritonX-100 | 5ml 100% Triton-X 100 | |
| 1mM DTT | 10μl 1M DTT | |
| 1mM PMSF | 34μl 0.3M PMSF | |
| inhibitor cocktail | 10μl inhibitor cocktail |
| 500ml贮存液 | 10ml工作液 | |
| 200mM NaCl | 10ml贮存液 | |
| 25mM HEPES pH7.5 | ||
| 2mM DTT | 20μl 1M DTT | |
| 1mM PMSF | 10μl 1M PMSF | |
| inhibitor cocktail | 10μl inhibitor cocktail |
| 500ml 贮存液 | ||
| 150mM NaCl | 15ml 5M NaCl | |
| 20mM Tris pH7.6 | 10ml 1M Tris pH7.6 | |
| 5mM MgCl2 | 0.5M MgCl2 | |
| 1mM DTT | 1M DTT |
| 500ml贮存液 | 10ml 工作液 | |
| 50mM Tris-HCl, pH7.5 | 25ml 1M Tris-HCl, pH7.5 | |
| 150mM NaCl | 15ml 5M NaCl | |
| 2mM EDTA | 2ml 0.5M EDTA | |
| 0.5% NP40 | 25ml 10% NP40 | |
| 0.5% Triton X-100 | 25ml 10% Triton X-100 | |
| 0.5mM DTT | 2.5ml 1M DTT | |
| 1mM PMSF | 100μl 100mM PMSF | |
| 1mM NaF | 1ml 0.5M NaF | 20μl 0.5M NaF |
| complete protease inhibitors |
原创作者：上海信帆生物科技有限公司
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