抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。这里选用ZLI-9001 APES、ZLI- 9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：

 

(1)APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。

 

(2)HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。

 

(3)Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。

 

2、常用酶消化：

 

(1)胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。

 

(2)胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin(层粘蛋白)，Collagen IV(IV型胶原)等。

 

(3)皂素(Saponin)：一般使用浓度为2~10 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。

 

3、抗原热修复：

 

可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)效果。枸橼酸盐缓冲液(粉剂)配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0±0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。

 

(1)石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3%H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟(注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求)。取出容器，室温冷却10~20分钟(注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却,以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。

 

(2)石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液(工作液)注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下,盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热5~6分钟后)，计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源,冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。

 

(3)石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后,放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。

 

4、免疫组化染色步骤：

 

(以美国ZYMED公司SP试剂盒为例)

 

(1)石蜡切片脱蜡至水。

 

(2)3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

 

(3)蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。

 

(4)5~10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

 

(5)PBS冲洗，5分钟×3次。

 

(6)滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释)，37℃孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

 

(7)PBS冲洗，5分钟×3次。

 

(8)滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37℃孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

 

(9)PBS冲洗，5分钟×3次。

 

(10)显色剂显色(DAB或AEC)。

 

(11)自来水充分冲洗，复染，封片。

 

5、冰冻切片免疫组化染色步骤

 

冰冻切片4~8um,室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。

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