我们在设计实验的时候通常对下列事情更感兴趣：1)测定未知样品的绝对量：如给定的血样中的病毒颗粒数，食品中某一种转基因成分的含量;2)未知样品与已知样品相比，基因的表达量改变了多少倍：如相当量的肿瘤组织和正常组织相比，p53mRNA改变了多少倍。分析这两种假设的方法就分别叫绝对定量和相对定量。

 

绝对定量是通过样品的Ct值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中(给定数量的细胞，每微克总RNA)中核酸的量(拷贝数、微克)。

 

相对定量的分析结果是在相当量的试验组(样品A)和对照组(样品B)中一个靶基因的相对比率(倍数差异)。

 

接下来我们就来看看我们在实验过程中如何来使用绝对定量和相对定量的分析方法。

 

5.1绝对定量分析方法

 

5.1.1绝对定量分析方法的使用条件

 

在这里我将举例来说明我们在实验过程中，何种实验需要用绝对定量来进行分析。医生对一个乙肝病人的每毫升血液中HBV DNA的精确拷贝数感兴趣。首先医生要从病人血液中提取DNA，然后通过荧光定量PCR实验来确定HBV病毒DNA的copy数。通过病人样品的Ct值和设置梯度稀释的已知HBV对照样品的标准曲线进行比较，医生就能确定病人血液中HBV病毒DNA的copy数。从这个例子，我们也可以看出，在实验过程中，如果*终的结果是对未知样品的定量描述，并不依赖别的样品的性质的时候，就应该使用绝对定量进行分析。

 

5.1.2绝对定量数据处理(举例)：确定某病人的血液提取的HBV病毒的精确量

 

如：PCR反应结束后，我们得到如下数据：

 

copies/ml Ct1 Ct2 Ct3 Mean Ct STD

5×103 27.61 27.58 27.84 27.67667 0.13

5×104 24.25 24.42 24.55 24.40667 0.08

5×105 21.11 21.04 21.16 21.10333 0.06

5×106 18.05 18.06 18.21 18.10667 0.08

BLANK None None None

sample 23.25 23.46 23.39 23.36667 0.05

注：平行样的Ct值之间的差<0.5时表示重复性较好

 

直接从荧光PCR仪上就可以得到标准曲线：

 

从标准曲线可以看出： r2=0.9995，大于0.98，标准差都在0.2范围内，而E=10-1/-3.2013=2.04，扩增效率=(2.04-1)×100%=104%，表示定量准确，可将未知样品的Ct值带入方程：

 

23.36667= -3.2013 X + 30.827 可得X=2.33

 

所以copies=(5×104/2) ×2.33=5.825×104

 

但我们需要注意的是，标准曲线只可能用于推算稀释梯度范围内的未知样本的量，而不能外推稀释梯度外的未知样本的含量。所以，我们在实验过程中尽可能使未知样品的浓度在标准品的稀释范围内。

 

5.2相对定量分析方法

 

5.2.1相对定量分析方法的使用条件

 

同绝对定量分析类似，我将举例来说明我们在实验过程中何种实验需要用相对定量来进行分析。我们如果想知道经过药物处理过的组织和未处理的组织中某一目的基因的表达水平是否有差异，相差多少倍?我们可以选择以下2种方式：

 

1)我们可以从等量的2种组织中提取RNA，分别进行目的基因的反转录特异性荧光定量PCR实验来确定目的基因在2种组织中的表达量，结果可以反映等量的2种组织中目的基因表达量的比率。

 

2)如果我们之前已经确定2种组织中看家基因如GAPDH的表达量相等，那么，我们就可以从大约等量(不需要等量)的2种组织中分别提取RNA，通过RT-qPCR实验来确定2种组织中目的基因和看见基因的表达水平。药物处理组织的目的基因的表达量可由2种组织中看家基因和未处理组织中目的基因的表达量共同来确定。

 

2种分析方法的差异就在于用的标准有所不同，方法1)中的标准是2种组织的量相等;方法2)中的标准是2种组织中看家基因如GAPDH的表达量恒定不变;

 

5.2.2相对定量数据处理(举例――2-△△Ct法)：药物处理后和处理前某组织X基因表达量的变化

 

5.2.2.1溶解曲线绘制与分析

 

熔解曲线的设置是在整个PCR完成后进行，从60℃升至95℃，每升高1℃仪器会自动收集荧光信号，得到的熔解曲线是逐渐下降的过程，且在Tm值下降*快，为方便分析，我们将温度与荧光强度的变化求导，即得到单峰的熔解曲线，这样我们就可以证明引物的特异性良好，实验结果不受非特异性扩增和引物二聚体的干扰(如下图，左为GAPDH基因，右为X基因)。

 

5.2.2.2数据处理

 

样品

X基因Mean Ct值

GAPDH基因Mean Ct值

△Ct

△△Ct

2-△△Ct

未处理样品

26.52

20.34

6.18

药物处理样品

24.18

20.12

4.06

-2.12

4.35

BLANK

None

None

 

下面我们来看看上面表格中差异倍数是如何得来的：

 

首先，分别求出6个重复样品X基因和GAPDH基因平均Ct值后，应用参照基因GAPDH对未处理样品和药物处理样品进行校正：

 

△Ct(未处理样品)=X基因 Mean Ct值-GAPDH基因 Mean Ct值=26.52-20.34=6.18

 

△Ct(药物处理样品)=X基因 Mean Ct值-GAPDH基因 Mean Ct值=24.18-20.12=4.06

 

然后，对未处理样品和药物处理样品的△Ct进行归一化：

 

△△Ct=△Ct(药物处理样品)-△Ct(未处理样品)=4.06-6.18=-2.12

 

*后，我们就可以根据△△Ct算出药物处理样品与未处理样品间X基因的表达差异：

 

2-△△Ct=2-(-2.12)=4.35

 

因此药物处理样本的X基因的表达水平是未处理样品的4.35倍。

 

上述结果是通过参照基因表达水平校正的待测样本中的目标基因相对于校准样本，用参照基因校准目标基因表达的目的是弥补样本组织量的差异。

 

为了更直观的表示样品间的表达差异，*后我们可以将计算得到的相对量用图表来表示，如下图：

 

2-△△Ct法的修正：

 

如果目标基因可参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么，2-△△Ct法的公式可以修正为用实际扩增效率值代替等式中的2。例如，如果目标基因和参照基因的扩增效率都为1.98，计算公式可以修正为1.98-△△Ct。

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