一、目的

1、学习分光光度计的原理和使用方法。

2、学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法。

3、进一步掌握比色法或分光光度法，准确测定未知样品。

二、原理

蛋白质浓度从它们的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收测定而得知，或用化学方法，如定氮，双缩脲反应，Folin—酚法是一般实验室中经常使用的方法。Folin—酚法是双缩脲法的发展，反应的步涉及到在碱性溶液中铜一蛋白质复合物的形成，然后这个复合物去还磷钼酸—磷钨酸试剂（Folin氏剂），产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）。Folin—酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。

所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用，浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%）乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色反应影响，这些物质浓度高时必须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅。则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1—2倍。

三、材料、试剂与器具

（一）材料

血清：使用前稀释100%

（二）试剂

1、标准酪蛋白溶液：称取125毫克酪蛋末，用0.1N氢氧化钠溶液溶解，加蒸馏水到250 毫升，则配成500微克/毫升的标准酪蛋白溶液。

2、Folin—酚试剂甲：由下述四种溶液配制而成。

（1）4%碳酸钠溶液

（2）0.2N氢氧化钠溶液

（3）1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液

（4）2%酒石酸钾钠溶液，在使用前，将（1）和（2）等体积混合成碳酸钠—氢氧化钠溶液。将（3）与（4）等体积混合配成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后将这两种溶液按50：1的比例混合，即为Folin—酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。

3.Folin—酚试剂乙：在2升的磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100克，钼酸钠（Na2MOO4·2H2O）25克，蒸馏水700毫升，85%磷酸50毫升和浓盐酸100毫升，充分沸合后以小火回流10小时，再加入硫酸锂（Li2SO4）150克，蒸馏水50毫升及数滴液体溴。然后开口继续沸腾15分钟，以驱除过量的溴。冷却后定容到1000毫升，过滤，溶液呈绿色。

用Folin—酚试剂乙滴定标准氢氧化钠溶液（1N左右）以标定Folin—酚试剂乙的浓度。以酚酞为指示剂。当溶液的颜色由红色变为紫红色、紫灰，再突然转变为墨绿时，即为终点。该试剂酸度一般为2N左右，此为贮存液。也可以用氢氧化钠去滴定Folin—酚试剂乙，但终点较不易掌握，此时溶液颜色由浅黄变为浅绿，再变为灰紫为终点。

使用前应予以适当稀释，使其成为1N的酸，此为Folin—酚试剂乙使用液。

以上两液均应装于棕色瓶内，贮于冰箱中，可以长期保存。

（三）器具

1、试管及试管架

2、吸量管（1，5毫升）

3、可见光分光光度计

四、操作步骤

（一）标准曲线的制作

取12支试管，分别加入0, 0.2 , 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升标准酪蛋白溶液（500微克/毫升）用水补足到1.0毫升，以上每种浓度各做一份重复，即平行做两份，按顺序向各管加入3毫升Folin—酚试剂甲，混匀，室温下放置10分钟，再依次向各管加入0.3毫升Folin—酚试剂乙，立即摇匀，在30℃保温（或室温下放置）30分钟，然后于500nm处比色。看两个平行管的光密度值是否接近，取其平均值，以光密度（0.D）为纵坐标，以酪蛋白溶液浓度为横坐标，绘制酪蛋白的标准曲线。

（二）血清样品的测定

取2支试管，各加入一定量血清稀释液（应使其蛋白质含量在酪蛋白标准曲线范围之内）本实验取0.4毫升血清稀释液，再加0.6毫升蒸馏水使样品体积达到1毫升。其他操作与“标准曲线的制作”相同。

（三）计算

将血清样品的光密度读数在标准曲线上查出相应标准酪蛋白溶液的浓度，再折算成每毫升血清稀释液含蛋白质的微克数。然后乘以稀释倍数，得出每毫升未稀释血清蛋白质的微克数，*后打算成临床化验上通用的单位克%，即100毫升血清中含蛋白质的克数。

五、注意事项

1、Folin—酚法所用的试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应，试剂乙（磷钼酸和磷钨酸混合液）在碱性条件下极不稳定，易被铜—蛋白质复合物还原成钼蓝和钨蓝。因此，在进行测定时加Folin—酚试剂要特别小心，因为Folin—酚试剂乙仅在酸性pH条件下稳定，但上还原反应只是在pH10的条件下发生，故当Folin—酚试剂乙加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀。以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，（还原反应即能发生）能有效地被Cu2+—蛋白质结合物所还原。

2、此法也适用于酪氨酸和色氨的定量测定。

六、实验报告

绘制标准曲线，将实验所获结果与其他蛋白定量测定方法比较，说明其优缺点。

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