(一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)

1.切片经二甲苯Ⅰ 5分钟。

2.切片经二甲苯Ⅱ 5分钟。

3. 无水酒精Ⅰ 30秒。

4. 无水酒精Ⅱ 30秒。

5. 95%酒精Ⅰ 30秒。

6. 95%酒精Ⅱ 30秒。

7. 90%酒精 30秒。

8.80%酒精 30秒。

9. 70%酒精 30秒。

10.自来水洗。(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)

11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。

12.水洗。

13.抗原修复。

14.PBS洗3次，1分钟/次。

15.加入血清孵育20分钟。

16.摔干血清，加入一抗60分钟。

17.PBS洗3次，2分钟/次。

18.加入二抗孵育30分钟。

19.PBS洗3次，2分钟/次。

20.加入ABC复合物，孵育30分钟。

21. PBS洗3次，2分钟/次。

22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。

23.PBS洗，水洗。

24.Harris苏木素染核5-10分钟。

25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln)

1.切片脱蜡至水。

2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。

3.水洗。

4.抗原修复。

5.PBS洗3次，1分钟/次。

6.加入血清孵育10分钟。

7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。

8.PBS洗3次，每次2分钟。加入二抗，孵育20分钟。

9.PBS洗3次，每次2分钟。

10.加入SP复合物孵育20-30分钟。

11.PBS洗3次，每次2分钟。

12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。

13.PBS洗，水洗。

14.Harris苏木素染核5-10分钟。

15.水洗，分化 ，蓝化，脱水，透明并封固。

(三)真空负压LSAB法

1.切片脱蜡至水。

2. 0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.

3. 水洗。

4.如果需要，可进行抗原修复。

5.PBS洗3次，每次1分钟。

6.加入正常血清真空负压处理5min。

7.摔干血清，加入抗体，真空负压处理5分钟。

8. PBS洗3次，每次2分钟。

9. 加入二抗(即连接抗体)真空负压处理5分钟。

10.PBS洗3次，每次2分钟。

11.加入链卵蛋白复合物，真空负压处理 5分钟。

12.PBS洗3次，每次2分钟。

13.DAB-H2O2孵育5-10分钟。

14.PBS洗，水洗。

15.染核，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

注：真空负压即将真空干燥中抽成真空。负压达66.7KPa(500mmHg)

(四)Envision TM Systems.

1.切片脱蜡至水。

2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

3.水洗。

4.抗原修复。

5.PBS洗3次，每次1分钟。

6.加入一抗体孵育30-60分钟。

7.PBS洗3次，每次2分钟。

8.加入增强剂孵育20-30分钟。

9.PBS洗3次，每次2分钟。

10.加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育20-30分钟。

11.PBS洗3次，每次2分钟。

12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。

13.PBS洗，水洗。

14.Harris苏木素染核5-10分钟。

15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(五)免疫组化双染色法。(ⅰ) (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method)

1.切片脱蜡至水。

2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

3.水洗。

4.抗原修复。

5.PBS洗3次，每次1分钟。

6.加入非免疫性动物血清，孵育10分钟。

7.PBS洗3次，每次2分钟。

8.加入抗体孵育60分钟。

9.PBS洗3次，每次2分钟。

10.加入生物素化的第二抗体，孵育10分钟。

11.PBS洗3次，每次2分钟。

12.加入链卵蛋白素过氧化物酶孵育10分钟。

13.PBS洗3次，每次2分钟。

14.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟。

15.PBS洗3次，每次2分钟。

16. 加入双染增强液，孵育10分钟。

17. 加入非免疫性动物血清孵育10分钟。

18. PBS洗3次，每次2分钟。

19. 加入选用的第二种抗体孵育60分钟。

20. PBS洗3次，每次2分钟。

21. 加入生物素标记的第二抗体孵育10分钟。

22. PBS洗3次，每次2 分钟。

23. 加入链卵蛋白素碱性磷酸酶孵育10分钟。

24. PBS洗3次，每次2分钟。

25. 加入AEC溶液，孵育5-10分钟。

26. 自来水洗。

27. 苏木素染核5-10分钟。

28. 水性封片。

注：1.种复合物也可先用链卵蛋白素碱性磷酸酶。

2.第1次显色也可用BCIP/NBT溶液，颜色为蓝黑色，但应与苏木素鉴别。

(六)、免疫组化的双染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method)

1.切片脱蜡至水。

2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

3.水洗。

4.抗原修复。

5.PBS洗3次，每次1分钟。

6.加入选用的抗体孵育30-60分钟。

7.PBS洗3次，每次2分钟。

8.加入增强剂孵育20-30分钟。

9.PBS洗3次，每次2分钟。

10.加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育

11.PBS洗3次，每次2分钟。

12.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟

13.PBS洗3次，每次2分钟。

14.加入选用的第二种抗体孵育60分钟。

15.PBS洗3次，每次2分钟。

16. 加入增强剂孵育20-30分钟。

17. PBS洗3次，每次2分钟。

18. 加入酶标抗兔/鼠碱性磷酸酶复合物孵育20-30分钟。

19.PBS洗3次，每次2分钟。

20.加入AEC溶液孵育5-10分钟。

21.自来水洗。

22.苏木素染核5-10分钟。

23.水性封片。

(七)细胞培养片免疫荧光染色法。

1.将细胞于载片或盖玻片的片子用生理盐水洗几次。

2.纯丙酮固定10分钟。

3.PBS浸洗3次，每次1分钟。

4.加入选用的抗体孵育120分钟。

5.PBS洗3次，每次2分钟。

6.加入荧光抗体孵育60分钟以上。

7.PBS法3次，每次2分钟。

8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。

9.水洗，蒸馏水洗。

10. 水性胶封片或用缓冲甘油封片。

(八)真空负压免疫荧光染色法染细胞培养片。

1. 将细胞爬于载玻片或盖玻片的片子用生理盐水浸洗数次，彻底洗去蛋白液。

2.纯丙酮固定5-10分钟。

3.PBS浸洗3次，每次1分钟。

4.加入选用的抗体孵育真空负压处理15分钟。

5.PBS洗3次，每次2分钟。

6.加入荧光抗体孵育真空负压处理15分钟。

7.PBS洗3次，每次2分钟。

8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。

9.水洗，蒸馏水洗。

10.水性胶封片或用缓冲甘油封片。

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