首先引物设计

引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应（即错配）。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度 （product length），序列Tm 值 （melting temperature），引物与模板形成双链的内部稳定性（internal stability, 用ΔG 值反映），形成引物二聚体（primer dimer）及发夹结构（duplex formation ａnd hairpin）的能值，在错配位点（ false priming site ） 的引发效率， 引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料[24]，引物设计应注意如下要点：
（1）引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
（2）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。
（3）引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
（4）引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大。
（5）引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件*佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4（G+C）＋2（A+T），在Oligo 软件中使用的是*邻近法（the nearest neighbor method） 。
（6）ΔG 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。
（7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。
（8）对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列。

1.1.1 PCR 的引物设计
首先从GenBank 查到VI 型胶原蛋白的α1 链的mRMA 序列，序列号为 NM_001848.其序列长为 4164bp，其中98 到3184 为VI 型胶原蛋白的α1链的编码序列，98 到865 编码VI 型胶原蛋白的α1 链的氨基端球状结构域，
866 到1873 编码胶原的三股螺旋结构域，1874 到3181 编码VI 型胶原蛋白的α1 链的羧基端球状结构域。
接着采用Primer Premier 5.0 进行引物设计，设计结果如下：

 
图2-1 Primer Premier 5.0 进行引物设计

由表中可知引物的GC 含量较高，扩增的片断较长，而且存在错配和引
物二聚体，在进行PCR 扩增时存在一定的困难。

1.1.2 胎盘组织总RNA 的提取
Trizol 法提取胎盘组织的总RNA
为防止RNA 酶污染，以下的操作均应戴RNA free 的一次性手套
（1）液氮研磨 将组织块直接放入研钵内，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软后，再加入少量液氮再研磨，如此三次，待组织充分磨碎后按 50~100mg/mlTrizol 加入Trizol 试剂，待化冻将其转入离心管中。
（2）室温放置10min，待其充分裂解组织。
（3）按200μl /mlTrizol 加入，振荡混匀5min，室温放置15min
（4）4℃ 12000g 离心15min。
（5）吸取上清水相转移至另一离心管中。
（6）按0.5ml 异丙醇/mlTrizol 加入异丙醇，混匀室温放置10min。
（7）4℃ 12000g 离心10min，去上清，RNA 沉淀于管底。
（8）加入适量75%的乙醇温和振荡离心管，悬浮沉淀。
（9）4℃ 8000g 离心5min，去上清，RNA 沉淀于管底。
（10）室温干燥（晾干）5～10min，RNA 样品不要过于干燥否则很难溶解。
（11）用20μlH2O （DEPC 处理后高压灭菌）或TE 缓冲液溶解RNA 于-20℃冷冻保存。
在这里说一下一般组织的处理方法：
器材准备
首先准备一个保温杯，隔热效果好一点，但是不要盖太紧，用于装液氮。
剪刀、镊子，无菌水，PE 手套。
过程：
取组织*重要的一点就是迅速。就地将组织取下（一定要新鲜），首先用无菌水冲洗几次，去掉血沫。戴上手套，用处理过的剪刀、镊子把组织剪成拇指盖大小的组织块，将这样的组织块放入RNA Free 的PE 手套中，立即将装有组织块的RNA Free 的PE 手套放入装液氮的保温杯，处理完后将保温杯带回实验室，从保温杯取出装有组织块的RNA FreePE 手套放入-70 度的冰箱中冻存。在研磨的时候，组织块还是太大，不好磨，容易蹦出来，我的做法是将组织块先取出来用液氮冻一下，然后放入RNA Free 的PE 手套中用锤或者厚背菜刀将其拍碎，在组织解冻之前迅速把拍碎的组织转移到研钵，在加入液氮把组织研成粉末，转移到离心管内。

1.1.3 RNA 样品电泳
利用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的胎盘 RNA：
（1）在已加有20ml 1×TBE 电泳缓冲液的三角锥瓶中加入准确称量的琼脂糖粉0.16g。缓冲液不宜超过锥瓶的50%容量。
（2）锥瓶口处加一较松的磨砂玻璃瓶塞，放入微波炉中用中火加热40 秒至琼脂糖完全溶解，室温下冷却至60℃，加入溴化乙锭（EB）1μl，充分混匀。
（3）将胶模放入胶槽中固定好，并在距底板0.5-1.0mm 的位置放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
（4）将温热的琼脂糖溶液倒入胶模中，凝胶的厚度在3-5mm 之间。检查梳子的齿下或齿间是否有气泡。
（5）在凝胶完全凝固后（于室温放置10-15 分钟），小心移去梳子，将凝胶放入电泳槽中。
（6）加入恰好没过胶面约1mm 深的足量电泳缓冲液（与凝胶中使用同一批次的电泳缓冲液）。
（7）取5μl RNA 样品与1μl 的6×Loading Buffer（溴酚蓝、二甲苯青FF、蔗糖水溶液或甘油水溶液的混合物）混合后，用微量移液器缓慢将混合物加入加样孔内。此时凝胶已浸没在缓冲液中。
（8）盖上电泳槽并通电，使DNA 向阳极移动。用1-5V/cm 的电压降（按两极间距离计算）。如果接线正确，则会在阳极和阴极处产生气泡（由于发生电解）。几分钟后，溴酚蓝从加样孔中迁移到凝胶中。继续电泳直至溴酚蓝和二甲苯青FF 在凝胶中迁移出适当的距离，一般溴酚蓝电泳至凝胶的中部即可。
（9）切断电流，从电泳槽上拔下电线，打开槽盖。取出凝胶。
（10）紫外灯下观察RNA 的移动情况并拍照。

检测RNA 溶液的吸光度
待测核酸以水为溶剂并作适当稀释（这里稀释400 倍：5μl RNA 样品+1995μl蒸馏水），使用1cm 光程的石英比色杯，以水调好仪器的零点，然后测定并记录样品液在280，260nm 处的吸光度。以估算RNA 的纯度和浓度。
280、320、230、260nm 下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD₂₆₀/OD₂₈₀（Ratio，R）。 1.8~2.0时，我们认为RNA 中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当用Tris 作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于2（一般应该是<2.2 的）。
当R<1.8 时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。当R>2.2 时，说明RNA 已经水解成单核酸了。
纯RNA 的A₂₆₀/A₂₈₀ 的比值为2.0。A₂₆₀/A₂₈₀ 的比值还表明RNA 的纯度，其值小于2.0 表明裂解液中有亚硫氰胍和β-巰基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。
RNA 浓度的计算
如果RNA 的量够，可在260nm（A₂₆₀）用分光光度法测定RNA 的得率，1个单位等于40μg/mlssRNA（单链RNA）。RNA 浓度=40μg/ml×A₂₆₀×稀释倍数

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