（一）萃取的过程主要要注意两件事：

1. To completely extract the total protein：将所有要的蛋白质完全萃取出来，如未萃取完全可能会造成极大的误差，在做比对工作时会造成误判。

2. To remove non-proteins：如何将非蛋白质得物质完全移除掉。 

（二）萃取时需考量的因素：

1.使用的样品是细胞或着是坚硬的组织。

2. 是否需要做分组的动作：由大范围缩减成小范围以利分析。

3. 哪些干扰的物质需要去排除？要移除的东西不见得不是蛋白质，有可能要移除掉大量存在的蛋白（如血液中的albumin、immunoglobin，量太多照成大量干扰）。

4. 要部分分离或是全部分离。 

（三）应用到的方法共有：

a. Cell or tissue sample distruption：打破的方法。

b.Protein precipitation：沉淀的方法，如利用TCA（trichloroacetic acid）沉淀，把要的蛋白质沉淀出来，不要的留在溶液中。

c.Protein Solubilization：如何把想要的蛋白质溶解，如一些膜蛋白为hydrophobic，非常难溶解。

d.Protease activity Inhibition：不能用太强的detergent，也不能利用TCA这种强烈的或化学物质，可能会破坏蛋白质的三度空间结构而失去活性。

e.Removal of non-protein，非蛋白质的部分包括：

－ nucleic acids

－ lipids

－ salts, buffers, ionic small molecules

－ insoluble material

a.打破细胞的方法：

1. Free-thaw or osmotic lysis：放入液态氮内急速冷冻，再放入37℃ incubator，让细胞处于忽冷忽热的环境，比较软的细胞会因此而破掉，如果是只要分离细胞核的话就可以利用这种方法。

2. Detergent lysis：可以用一些detergent溶掉细胞膜，使细胞内的物质流出。

3. Sonication：超音波震盪，比较强烈的方法，会打烂所有的胞器，在想看细胞内所有的protein时使用，通常是事先未知我们要看的蛋白质为在何处。

4. Enzymatic lysis：比较温和的方法，只要去破坏细胞的某一些结构。可利用 pectinase, cellulasae, lysozyme or lyticase™, 例如：只想要移除细胞壁时可利用cellulase。

5. French pressure cell：高压的方法，通常用在有细胞壁的微生物。

6. Grinding（motar ａnd pestle）：用研磨的，通常用在比较坚硬的组织。

7. Machanical homogenization：均质器，也属于研磨的方法，通常用在比较坚硬的组织。

※的方法：是要根据所要研究的对象去判断。

b.沉淀的方法：

1. Ammonium sulphate（salting out）：将大量ammonium sulphate加入蛋白质溶液中，随着盐类浓度的增加，与蛋白质竞争水分子，蛋白质的hydophobic suface会曝露出来，因为hydrophobic interaction，蛋白质彼此间会聚集而被沉淀出来。用此法容易保留蛋白质活性，但是会残留大量盐类，很难去盐，而且有时候用硫酸铵沉淀效果不是很好

2. TCA（trichloroacetic acid） precipitation：使蛋白质溶液的pH改变，而达到蛋白质的等电点，使蛋白质沉淀下来。沉淀效果好，可以大量去做，但是强烈的药物容易破坏蛋白质的三级结构，而使之丧失活性。

3. Acetone and/or ethanol：蛋白质在含有不同浓度有机溶剂的溶液中，会具有不同的溶解度。随着加入有机溶剂浓度的增加，与蛋白质竞争水分子，使蛋白质曝露出charge group，因发生ionic interaction而聚集沉淀下来。

4. TCA plus acetone 

c. 蛋白质的溶解（Protein solubilization）

1. Urea（8-9.8 M）, or 7 M urea / 2M thiourea：替蛋白质作一些unfolding的动作，希望蛋白质不会全部纠结在一起，这样做IEF时蛋白质才会停在正确pI的位置，不会有一些负电荷包埋在裡面的情形

2. Detergent（CHAPS [3-（3-cholamidopropyl）dimethylammonio]-1- propanesulfonate）,…）：有一些蛋白质在缓冲液或水中不好溶，因此会加入一些detergent帮助溶解，但是在做IEF时会通很高的电压，所以用的detergent一定要是电中性，不然会造成很强的电流，使蛋白质变性，更严重的是会造成整个电路的短路。CHAPS是一种zwitterionic detergent，是目前很常用的detergent。SDS不适用，SDS带负电。

3. Reductant（DTT, DTE, TBP）：去掉胺机酸的Cysteine的双硫腱，DTT（dithiothreitol）可以用来还原双硫键，以利作蛋白质电泳分析，在溶液中含有低溶度（1mM）dithiothreitol时，有避免蛋白质氧化的作用。DTE（dithioerythritol）在pH大于8会带负电，会对IEF有不良影响。新开发出来的还原剂TBP（tributyl phosphine）不带电，不受电场及pH的影响，同时对于膜蛋白跑2D也比较好。

4. Carrier ampholyte（IPG buffer）：用来做pH gradient。

（1）Sonication can help solubilization：

样品处理完，药都加完，再做超音波震盪一下，可以增加蛋白质的溶解度，在做2-D electrophoresis有利蛋白质的分离。增加蛋白质的溶解度非常重要，因为在做IEF dimension时，是让蛋白质停在等电点的位置，在等电点的时候，蛋白质溶解度*差，容易沉淀下来，一但沉殿，就卡在胶体上，之后去做2D second dimension时就不会在移动，*后就不会在胶体上看到蛋白质的正确位置。因此跑2D时问题通常都是出在IEF dimension，会有沉淀的问题以及杂质的问题。

（2）Sample can be heated only perior to addition of urea：

加urea之后不可以再加热，因为urea加热时会产生另外一种化学物质，形成双键，修饰在蛋白质上，特别会修饰胺机酸lysine，使得trypsin 原本切胺机酸lycine C-terminal位置因为被urea修饰而造成不能切，使得要做蛋白质分析时，protein没有办法变成较小的peptide片段，做质谱仪分析的时候就不能精确的策到peptide片段。

d.Protease inhibitors：

在分析的蛋白质中难免会残留一些protease在我们加入trypsin去作用这些蛋白质时，难免会先被这些protease破坏，因此一定要确定抑制住protease的活性。

1. 苯甲基磺醯化氟PMSF（phenylmethylsulfonyl fluoride）：*常用的，用来抑制serine ａnd cysteine protease的活性。具有毒性，在水溶液中可藉由DTT ａnd 2-mercaptoethanol来去PMSF活性。

2. AEBSF（Aminoethylbenzylsulphonyl fluoride）：也是用来抑制serine和cysteine protease，水溶性较好，毒性较PMSF低，但可能造成蛋白质彼此共价键互相作用，影响蛋白质的pI值。

3. EDTA：抑制matalloprotease。

4. Peptide protease inhibitors（leupeptin, pepstatin, aprotinin bestatin…etc）：可用来抑制Serine-, cystine-, aspartyl-proteases, aminopeptidases，缺点是成本较高，且有可能出现在2D pattern中。

5. High pH：抑制大部分的protease。

e. Nucleic acid removal

核酸也是细胞中含量非常多的一部份，也要将之移除乾淨，移除可利用下列方法：

DNase I ａnd Rnase A are commonly used：可利用酵素移除，但要注意DNase本身也是一个蛋白质，必须要注意加入是否会污染到sample。

Nucleases：Nucleases本身也是protein，因此也会受到urea的破坏，当在8M urea中就无法作用，所以必须在加入urea之前就加入。

DNase I ：会出现在2D map中，因为本身也是蛋白质

Benzonase：同时具有DNase 及RNase的活性，可同时去掉DNA ａnd RNA，目前很常用

Sonication works very well：有的人不喜欢用Nuclease，直接用超音波去振，然后用超高速离心将DNA沉淀下来，此方法可以避免可能污染的问题，也比较省钱

f.De-salting techniques

为何要去盐？如果不去盐，在跑2D or SDS的时候，因为盐类也是导电物质，会造成导电度变大，产生大量的热。

˙Dialysis：利用扩散的原理，很难百分之百去乾淨，有一点残留上2D的还是有问题，电压上不去。

˙Spin dialysis：利用过滤膜，然后去离心，离心力太大的话，连分子量很大的都过的去，回收率不好，因容易残留在膜上。

˙Gel fitration：好处是去盐可以去的很乾淨，但缺点是因为要流colum，当sample多的时候会耗掉非常多时间。

˙TCA 沉淀：可以很有效的去盐，但是由于沉淀的东西非常紧密，sample非常难回溶，很耗时。

※注意：各种方法都有优缺点，没有一种完美的方法。要考量所要研究的东西，实验的目的去决定要应用哪一种方法或是配合使用。

原创作者：上海信帆生物科技有限公司