信帆生物告知您：PCR实验引物设计的原则及注意事项！

上海信帆生物科技有限公司代做RT-PCR实验，实时荧光定量PCR检测服务，欢迎大家来电咨询！

下面由上海信帆生物的技术告知您引物设计时候的一下注意事项：

引物的设计
 
毫无疑问，引物的碱基组成，长度及其靶序列的同源性是决定PCR成败的首要因素，选择设计引物在一定程度上仍然要靠经验，对于某一对引物而言尚无通用的规则可严，但应遵守以下原则： 
（1）一般性原则： 
①长度：15～30bp，其有效长度 [Ln=2 (G+C)+(A+T)] 一般不大于38，否则PCR的zui适延伸温度会超过Taq酶的zui佳作用温度（74℃），从而降低产物的特异性。 
②G＋C含量：应在45%～55%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5～10度。引物长度小于20时，其Tm值等于4×(G+C)+2×(A+T)。 
③ 碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现3个的连续的G或C，否则会使引物在G＋C富集序列区错误引发。 
④ 引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。 
⑤引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。 
⑥特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70%，或少于连续8个的互补碱基。 

信帆生物告知您：PCR实验引物设计的原则及注意事项！

（2）引物的3’端： 
引物的3’端很大程度上影响Taq酶的延伸效应，除特殊情况（AS-PCR）外，3’端不应发生错配。S. Kwok等发现，引物的3’端发生错配时，A:A使产量下降至1/20，A:G或C:C下降至1/100。当末位碱基是T时，即使错配也能引发链的合成，而为A时错配的引发效率zui低，G、C居间。 
因此，引物的3’端碱基zui好选用A、G、C，而尽可能地避免选用T，尤应避免连续出现2个以上的T。 
此外，如果扩增编码区域，引物的3’端不要终止于密码子的第3位，因此处易发生简并，从而影响扩增特异性。 

（3）避开引物的二级结构区： 
某些引物无效的原因是引物重复区二级结构的影响，因此选择扩增片段时应注意避开二级结构区，有些计算机软件可帮助确定该区域，如不能避开，则可用7- deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP，有助于PCR成功。 
目前在引物选择中已广泛应用计算机软件，从EMBL或Genebank中查找有关基因序列，并依据上述原则对所选用引物进行评价。 

信帆生物告知您：PCR实验引物设计的原则及注意事项！

原创作者：上海信帆生物科技有限公司