实时荧光定量PCR（Real-Time PCR)实验中引物的选择和设计要求

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反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求

1)随机六聚体引物：

当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

2)Oligo(dT)：

是一种仅对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3＇端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR)实验中引物的选择和设计要求

3)特异性引物：

*特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，条链的合成可由与mRNA3’端*靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

做 Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

① Tm=55-65℃

② GC=30-80%

③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。

④ 引物的退火温度要高，一般要在 60℃以上。

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都应该可以的。做染料法*关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备－－-寻找合适的引物非常不易。

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR)实验中引物的选择和设计要求

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