明胶酶谱检测试剂盒

明胶酶谱法是一种新型的蛋白质分析方法，它可以提供准确的蛋白质质量分析和分子量分析结果。明胶酶谱法可以快速有效地测定蛋白质中的氨基酸和糖基化激酶的活性。这种方法通

过使用蛋白质，核酸和其他复合物构成的聚合物，结合相关的酶诱发反应，来分析蛋白质的质量和分子量。这些复合物可以在单独的氨基酸片段中用来测量激酶反应，从而识别活性位点，反映了蛋白质质量和分子量分析的结果。

明胶酶谱法的原理是基于胶质酶结合物，它由多种蛋白质，核酸和其他复合物组成，使用酶

诱发反应来分析蛋白质的质量和分子量。该方法由激酶和聚合物组成，它们分别催化了激酶和聚合物的反应，从而产生了激酶的活性。此外，该方法还能够测量氨基酸片段的活性，这将有助于评估蛋白质的质量和分子量。

本试剂盒采用酶谱法(zymography)检测 MMP-2、MMP-9 活性Zymography 是一种广为使用的、基于 SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达 1nM，高于 ELISA 方法 2，其基本原理和程序是: 制备加有胶原酶底物的 SDS-PAGE 凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳结束后取出凝胶与酶反应 Buffer 孵育，凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解舒胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透 亮区域，从而能同时指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9 特异蛋白底物及酶学反应缓中液，可检测少至0.10-0.5ul血液中的MMP-2、MMP-9 谱及活性，检测灵敏度~1 nM。试剂盒可进行 50 次标准小较检测，如果小较加样为 10-15个，则总计可检测500-750 个样品。

检测目的:

本试剂盒用于检测MMP-2、MMP-9 酶谱及活性（Detect MMP2 ａnd MMP9 as low as 1nM）

检测步骤：

5.1 制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化，并90 ºC 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。、

5.2 待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker 即可。阳性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积混合，取5-15μl 上样。

注：因为全血成分复杂,MMP活性较低，的方法是将全血中白细胞进行分离做阳性对照

5.3 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

5.4 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液。

5.5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或37ºC 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小时即可显示。如MMP 活性低，应延长孵育时间为10小时或过夜。

5.6 显色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。

5.7 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色。MMP 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。

试剂盒组成与储存:

A. 2 x SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml, -20℃保存

B.10 x Substrate G, 50 ml,-20℃保存:

C.10 x Buffer A,50 ml,4℃保存,使用时用蒸馏水稀释

D.10 x Buffer B,50 ml,4 ℃保存,使用时用蒸馏水稀释:

E.SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液,50ml,4℃保存

注意事项

1.10 mM EDTA能够抑制MMP活性

2.凝胶干燥:可使用聚丙烯-酰胺凝胶干胶装置室温快速干燥凝胶，作为记录保留。

3.本试剂盒仅供科研实验使用，不得用于食用、临床医疗等其它用途。

4.实验操作中，请穿戴好实验服、防护口置和一次性实验手套，避免直接接触，严禁入口。

使用该试剂盒发表的文章:
 

参考文献：

1. Nagase H ａnd Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

2. Heussen C, ａnd Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide

gels containing sodium dodecyl sulfate ａnd copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102,196–202

明胶酶谱检测试剂盒

原创作者：上海信帆生物科技有限公司