资料简介：  细胞CAMKII激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

本所细胞CAMKII激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到CAMKII磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应，即采用光度法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析细胞裂解样品中CAMKII活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中CAMKII激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景

Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases；CAMK；EC2.7.11.17）属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家属成员，主要由Ca2+/钙调素复合物调控，在细胞分裂和分化、神经传导介质分泌、转录因子调节、糖原代谢、肌肉收缩、记忆、心功能等方面发挥作用。在大多数组织中表达，尤其在神经组织中高度表达。功能分类为特异型，其代表为肌凝蛋白轻链蛋白激酶（myosin light chain kinase；MLCK）和多功能型，其代表为Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases II；CAMKII）。亚型分类为I型、II型、和IV型。亚体分类为α、β、γ、δ四种。Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶有3个结构域：N端催化域（catalytic）、中央调节域（regulatory，包含自发抑制域——autoinhibitory domain；AID和Ca2+/钙调素结合中心），和C端协同域（association），Ca2+/钙调素复合物激活CAMK后，产生自发性自我磷酸化。Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II主要作用于中枢神经系统，调节细胞内钙离子瞬时变化，诱导长时程增强（potentiation）、突触可塑性（synaptic plasticity）、神经传导介质合成和释放、与记忆和学习功能相关。其磷酸化目标序列为KKALRRQETVDAL。基于底物KKALRRQETVDAL，在ATP的存在下，受到Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II的活性。其反应方式为：

产品内容

本所清理液（Reagent A）  毫升

本所裂解液（Reagent B）  毫升

本所缓冲液（Reagent C） 毫升

本所酶促液（Reagent D） 微升

本所反应液（Reagent E） 微升

本所底物液（Reagent F）  微升

本所阴性液（Reagent G） 微升

产品说明书   1份

保存方式

保存本所清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

CAMKII激酶：用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离

（微型）台式离心机：用于样品预处理

100微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析

实验步骤

一、 待测样品准备

1． 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）

2． 小心加入xx毫升本所清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升本所清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升本所裂解液（Reagent B），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡15秒

12． 置于冰槽里孵育30分钟

13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用本所 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里 

2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零

3． 本所缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1． 移取xx微升本所缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升本所阴性液（Reagent G）

3． 放进30℃培养箱里静置10分钟

4． 加入xx微升本所酶促液（Reagent D）

5． 加入xx微升本所反应液（Reagent E）

6． 加入xx微升本所底物液（Reagent F）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

四、 样品测定

1． 移取xx微升本所缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）

3． 放进30℃培养箱里静置10分钟

4． 加入xx微升本所酶促液（Reagent D）

5． 加入xx微升本所反应液（Reagent E）

6． 加入xx微升本所底物液（Reagent F）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

五、 计算样品活性

六、 酶标仪测定

1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取xx微升本所缓冲液（Reagent C）到96孔板里

3． 分别加入xx微升本所阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）

4． 在30℃温度下孵育10分钟

5． 分别加入xx微升本所酶促液（Reagent D）

6． 分别加入xx微升本所反应液（Reagent E）

7． 分别加入xx微升本所底物液（Reagent F）

8． 轻轻摇动96孔板

9． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数

10． 活性计算：

七、抑制剂筛选

1． 在96孔板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品

2． 按下表加入试剂，进行样品预处理

3． 分别加入xx微升本所酶促液（Reagent D）

4． 分别加入xx微升本所反应液（Reagent E）

5． 分别加入xx微升本所底物液（Reagent F） 

6． 轻轻摇动96孔板

7． 即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟

8． 抑制活性计算：

注意事项

1． 本产品为25次操作，包括背景操作

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 样品处理忌用磷酸缓冲溶液 

5． 样品须澄清，至关重要 

6． 启动反应后3秒内即刻光度测定

7． 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟

8． 光度测定后，比色皿须清洗彻底

9． 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性

10． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供 本所 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1） 

11． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

12． 可以使用CAMKII抑制剂（KN-93；IC50=370纳摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照

13． Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

14． 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感

使用承诺

公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。