Nature：单细胞和空间转录组揭示类原肠胚中的体节发生
 

类原肠胚是胚胎干细胞的三维聚集体，在移植后表现出哺乳动物发育的关键特征，包括胚层分化和轴向组织。目前为止，只有少数基因的表达模式在类原肠胚中被显微镜探索，而且尚不清楚类原肠胚中全基因组表达模式多大程度上模仿了胚胎中的表达模式。本文使用单细胞 RNA 测序和空间转录组比较了小鼠类原肠胚和小鼠胚胎。鉴定到了多种之前在类原肠胚中未知的胚胎细胞类型，并表明体节发生的关键调控因子在胚胎和类原肠胚之间表达相似。利用活体成像，作者发现体节发生时钟在类原肠胚中活跃并且具有与体内类似的动力学。由于类原肠胚可以大量生长，作者通过一个小的筛选揭示 FGF 信号减少如何导致胚胎中短尾表型。*后作者证明基质凝胶中包埋可以诱导类原肠胚中产生正确头尾模式的体节，随着时间的推移依次出现在前后方向。本研究显示了类原肠胚作为一个模型系统的能力，可以通过高通量的方式体外探索发育和体节生成。

先前研究表明，整个类原肠胚在聚集 120 小时后的转录组与小鼠 E8.5 胚胎干细胞类似。为了将这一特性扩展到单细胞水平，作者将单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）应用于小鼠胚胎干细胞系 E14-IB10或 LfngT2AVenus 聚集 120 小时后产生的 100 个类原肠胚获得的 25,202 个细胞和高度可变基因基础上聚集的细胞（图 1a）。为了注释这 13 个 clusters，作者将其转录本与 E8.5 小鼠胚胎 scRNA-seq 数据进行了比较。结果证实了前神经元细胞类型的缺失和外胚层细胞的存在类似于胚胎脊髓（cluster8）。还鉴定到了内皮细胞和血内皮细胞（cluster10），并发现了一簇具有原始生殖细胞和胚胎外胚层特征的细胞（cluster12），cluster13 与内脏内胚层有关。

 

在探索 clusters1-8 细胞时，作者观察到这些细胞沿神经和中胚层分化轨迹排列。首先，从 cluster7 到 cluster8 观察到一个神经中胚层前体到神经分化的轨迹。其次，从 cluster6 到 cluster2 观察到中胚层分化轨迹。*后，cluster1 为心脏标记物。

 

神经和中胚层分化轨迹具有很强的空间成分：神经中胚层干细胞位于尾芽内，分化组织位于更靠前的位置。为了确定类原肠胚中是否存在这一情况，作者将空间转录组技术 RNA 断层扫描（tomo-seq）应用于 120 小时 E14-IB10  和 LfngT2AVenus 类原肠胚。两种 ES 细胞系产生的类原肠胚的总体基因表达模式相似（图 1b）。为了注释不同的表达域，作者将每个 tomo-seq cluster 的基因平均表达映射到 UMAP 图上（图 1c）。这表明神经中胚层干细胞位于类原肠胚*后部。分化程度较高的神经细胞在稍前面，在 UMAP 图中，中胚层 cluster 按顺序排列：cluster6 在*后面，cluster2 在*前面（图 1b）。并发现类原肠胚前区包含心脏、内皮细胞和头间充质细胞。

 

为了进一步研究类原肠胚前后基因表达模式与胚胎的相似程度，作者将 tomo-seq 应用于 E8.5 小鼠胚胎（图 1d）。比较类原肠胚 tomo-seq 数据集和先前发表的微阵列数据集发现 E9.5 小鼠胚胎后中胚层被分为 7 个区域，以恢复基因表达模式（图 1e）。

 

 

 

图 1 小鼠类原肠胚与胚胎 scRNA-Seq 和 tomo-Seq 对比

 

 

 

在胚胎中，中胚层的组织是由动态的基因调控网络建立的，这些网络与体细胞发生的过程紧密相连。在体节发生过程中，视黄酸和沿着前后轴相反的 FGF/WNT 信号梯度决定了分化的前沿位置，从而诱导中胚层分化为体细胞上皮块（图 2a）。为了研究类原肠胚分割时钟是否活跃，作者对 LfngT2AVenus 小鼠 ES 细胞产生的类原肠胚进行荧光实时成像来监测 Notch 信号活性。观察到 Lfng 低表达振荡波和一个从尾芽的尖端向分化前沿移动大约 2 小时的周期（图 2c-e）。这些实验表明，在类原肠胚的分割时钟是活跃的，其动态与体内的情况非常相似。MEK 抑制剂 PD03 可以抑制 FGF 信号，并以剂量依赖的方式加速分化前沿，而不改变类原肠胚生产速度（图 2f）。

 

 

 

图 2 小鼠类原肠胚分节时钟的扰乱和实时成像

 

 

 

尽管在本实验表明，体节发生的关键调节因子在正确的位置表达，类原肠胚中分节时钟活跃，但先前报到类原肠胚并没有产生体节。成像实验中偶尔观察到分化前出现小凹痕，这些凹痕仅在 96 小时基质凝胶中的类原肠胚可见。为了探索基质凝胶浓度的影响，作者进行了滴定实验，并发现在 10-25% 的基质凝胶中嵌入 96h 的类原肠胚可以形成清晰的节段，在后半部 marker 基因 Uncx4.1 在超过 50% 的类原肠胚中表达（图 3a）。类原肠胚实时成像显示这些节段在基因 Lfng 表达域前面依次出现（图 3b）。Uncx4.1 和 Tbx18 双重染色结果显示 Uncx4.1 和 Tbx18 呈交替表达（图 3c）。实验表明在低百分比基质凝胶中嵌入类原肠胚诱导类体节结构的形成，具有正确的喙尾模式并随时间依次出现。目前并未发现类原肠胚有邻近的体节。

 

 

 

图 3 类原肠胚嵌入低百分比的基质凝胶中体节形成的染色和实时成像

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