红细胞膜如何制备-上海信帆生物为您答疑解惑


红细胞膜的制备：

1、 原理和应用 ：

 哺乳动物细胞是生物质膜*方便，*经济的来源，除来源广泛以外，这种细胞还不含任何细胞器，从而可以得到一种纯净的细胞质膜。红细胞血影（ghost）膜主要是采用低渗透处理来获得的，在低渗介质中，红细胞膨胀，由双面盘状变成近乎球形，随后细胞内容物包括血红蛋白成分因细胞破裂而释放出来。*后，通过离心沉淀技术可获得纯净的红细胞膜（又称红细胞血影膜）。

2、 仪器和设备：常速离心机和低温高速离心机

3、 试剂(建成生物工程研究所可订购)

①、等渗缓冲液（本所有售）

②、低渗缓冲液（本所有售）

4、 实验步骤：

①、收集血液并洗涤红细胞：

将血液标本直接收集到已肝素化的容器内，立即在4℃离心（1500转/分，10分钟），用吸管吸去上清液并小心吸去压积红细胞上层的白色绒毛状膜成分（即白细胞等）。将压积红细胞用10倍体积的4℃等渗缓冲液或生理盐水悬浮，依照上述离心条件离心，如此重复2～3次，直至上清液无色，而且没有上层白色绒毛层，用吸管吸除上清液，保留压积红细胞。

②、制备细胞膜：

取压积红细胞，按1：10的比例加入低渗缓冲液，混合均匀，在4℃环境中放置20分钟，由于溶血，细胞悬液由鲜红色变成透明暗红色，（将此悬液对着日光灯看呈透明）。然后在低温高速离心机上平衡离心（20000g×30分钟，一般为8000～12000转/分×30分钟，4℃。），取出离心管可见底部有一块粉红色沉淀，小心吸去或倾斜离心管缓慢倒出暗红色上清液。沉淀部分再加入10倍体积的低渗缓冲液，混合均匀后重复离心（20000g×30分钟或8000～12000转/分离心30分钟，4℃）两次或三次，直至沉淀部分呈现乳白色，弃去上清及离心管底部褐色的纤维蛋白样沉淀斑，收集白色或浅粉红色血影膜。

③、血影膜的收集和保存：

将血影膜悬浮于一定体积的低渗缓冲液中，混合均匀，取少量样品用考马斯亮兰法或Lowry氏法或其他方法测定蛋白含量。按需要将血影膜用低渗缓冲液稀释成一定蛋白含量的悬液，定量分装到小容器中，分次使用从而避免膜样品反复冻融，在-20℃，-40℃，-70℃或液氮中贮存备用。

④、血影膜的鉴定：

细胞膜的生物化学性质可用乙酰胆减酯酶、Na+K+-ATP酶活性来鉴定；其形态特征可用相

差光学显微镜和透射电子显微镜来观察。

5、 注意事项：

①、红细胞可来源于人和其他哺乳动物（如大鼠、小鼠、猪、羊、牛、兔等），也可直接购买当地中心血库（或血液供应站）的全红细胞，后者可免除其他血细胞的干扰。

②、去除血红蛋白的程度不仅取决于溶血缓冲液的pH值，而且取决于缓冲液的渗透压。PH值过低，渗透压过高都会造成血红蛋白贮留，血影膜沉淀呈现粉红色。此外溶液中的二价离子浓度达1～5mmol/L时也会使红蛋与白明显贮留。细胞低渗溶血缓冲液的体积比应该在1：10左右，比例过大或渗透压过低则会增加非血红蛋白蛋白质的损失和膜的破裂，所以，要得到“完整的”无血红蛋白的膜则需要注意上述几点。

③、细胞和膜的贮存时间要依研究目的而定。通常，要尽快使细胞与血浆分离，并用等渗缓冲液或生理盐水洗涤。在50%的比容下，悬液能在4℃保存过夜，但应在24小时内使用。由于白细胞有较高的蛋白酶活性，对细胞的保存影响较大，因此在制备过程中应尽可能去除。细胞膜的制备应在当日内完成，4℃贮存细胞或细胞膜会使得非血红蛋白的蛋白质损失增加，冻存对细胞膜也是有损伤的，如果可能是在膜制备完成后就进行相应的检测，即使贮存也应该贮存于低渗缓冲液中，并尽快测试。

④、严格控制膜的洗涤次数，次数过多会使膜酶活性降低而影响其生化功能。

⑤、一般来说，其他哺乳动物红细胞（如牛、猪、狗、大鼠等）对低渗溶血的表现是相近的，但也不能简单地认为所有这些红细胞在形态学和生物化学性质等方面都是一致。

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