一：试剂盒组成：

二：标本制备：

取肝素抗凝（25μl/ml）的静脉血1～2ml，PBS稀释1-2倍后，沿装有等量淋巴细胞分离液的试管壁混匀缓慢加至液面上层，保持两种液体界面清晰，离心（2000转/分）15-20分钟，吸取两液面交界处的单个核细胞层，加5倍PBS，离心（1000转/分）5分钟，弃上清液，沉淀即为单个核细胞。利用试管中剩余的少许回流液体（约一滴）混匀细胞，制成单个核细胞悬液。滴30μl细胞悬液于载玻片上，静置2分钟使细胞下沉粘附于玻片上，吸去液体，快速吹干或37℃温箱1小时烤干。或用PBS将单个核细胞调至2×10⁵个/ml，离心涂片机1000转离心1-2分钟制片，快速吹干或37℃温箱1小时烤干。涂片前取防脱片剂5-10μl均匀推片，亦可用棉签粘取防脱片剂均匀涂于干净玻片上，待干后制备细胞涂片，以防掉片。

三：显色剂的配制：

分别取A液25ul，B液25ul置于干净试管中混匀，室温放置2-5分钟，加1ml蒸馏水，混匀，再加C液100ul待用。

*使用前，根据所需显色剂用量，按照以上比例现配现用。

四：标本染色：

       1. 充分干燥（室温2小时以上或过夜）的细胞涂片先用记号笔在标本外画圈，然后滴加固定液50μl，室温静置2-3分钟，用PBS淋洗，擦干玻片背面及细胞外的PBS。

*以下反应均需在湿盒中进行。

2. 分别滴加抗人CD3、CD4、CD8单抗适量(10-30μl）,4℃过夜，PBS淋洗3次。

3. 滴加生物素标记抗小鼠IgG适量（10-30μl），37℃孵育30-45分钟，PBS淋洗3次。

4. 滴加碱性磷酸酶标记链霉卵白素适量（10-30μl）37℃孵育30-45分钟，PBS淋洗3次。

5. 滴加显色剂30-50μl，室温显色20-40分钟。可在显微镜下观察，待细胞膜上出现红色标记物时，用PBS淋洗。

6. 滴加细胞核复染液30-50μl，30秒后自来水淋洗。

7. 滴加封片剂，盖片封片，镜检。如不需保存亦可用水替代封片剂盖片镜检。

五：观察：

高倍镜下选取染色好的视野记数100-200个单个核细胞，细胞表面有红色标记物为阳性细胞。算出阳性率。

六：正常参考值：

正常人外周血中，阳性细胞百分率一般在：CD3，60-80%；CD4，35-55%；CD8，20-30%；CD4/CD8的比值在1.5-2.0范围内。

七：储存条件及有效期：

2-8℃保存，禁止冷冻，有效期为12个月。有效期内可在0-25℃范围内七天短时运输。使用时应及时及拿及用，使用后应立即放回冰箱。生产日期，使用期限或失效日期见标签。

八：注意事项：

1. 免疫细胞化学检测是一种包含多步骤的检测方法，试剂的选择、样本的处理、涂片的制备、染色及其结果的判读均需要进行专业的培训。

2. 任何阳性或阴性的解读，应由病理科医生结合病理形态学，临床表现及其它检测方法进行，不作为单独的诊断指标。

3. 复染过度或不足都可能影响结果的判读。

4. 阴性结果表示未检出抗原，不一定表示样本中无该抗原存在，待测抗原编码基因变异，抗原低表达或抗原修复不当等，都会造成抗原无法检出。

5. 本试剂仅对经处理的人外周血细胞进行验证，不做其他用途

6. 试剂盒使用中，应有适当的防护措施，以避免试剂同皮肤和眼睛接触。

 T细胞亚群检测试剂盒-上海信帆生物