1 、产品介绍

NuPerley Boronate填料是在新一代高刚性琼脂糖凝胶微球骨架的表面设计特定的间隔臂后，再偶联3-氨基苯硼酸形成的亲和层析介质。苯硼酸配基在弱碱性条件下可与1,2-顺式二醇通过可逆共价键形成硼酸酯，可特异性结合含1,2-顺式二醇结构的物质，包括糖蛋白（包括抗体）、酶、多糖、核苷、核苷酸和儿茶酚等多类生物分子。也可通过NADP+或ATP来辅助分离纯化不能直接与填料结合的目标分子。因特异性高，且用途广泛，使用本产品的纯化过程可单独归类为硼酸亲和层析（Boronate affinity chromatography，BAC）。

2 、产品特点与技术指标

注：a90%体积以上的微球在此粒径范围；b 10 cm 柱高下的测试流速。

3、硼酸亲和原理

NuPerley Boronate与1,2-顺式二醇结构形成的可逆共价键（硼酸酯）是层析过程的主要作用力（图 1）。pH=8.5 以上有利于填料与目标分子以硼酸酯的形式结合，但生物分子的分离纯化较少用到pH=9.0以上的条件；pH=4.0~6.0则有利于硼酸酯的解离。除了可以降低pH将目标分子洗脱，也可以用山梨-醇、甘露-醇等含1,2-顺式二醇结构的糖 类进行竞争洗脱。

除了可逆共价键，配基中存在苯环这一疏水基团，可能与含苯环的物质之间存在π-π相互作用，这要求上样缓冲液的离子强度不能过高，通常在~50mM，以降低疏水相互作用造成的非特异性吸附。硼酸酯的四面体结构带负电荷，为降低离子相互作用造成的非特异性吸附，又要求结合过程有较高的离子强度。NuPerley Boronate 通常在50~500mM的离子强度下与目标分子有较优的特异性结合。二价阳离子可降低离子相互作用和疏水相互作用造成的非特异性吸附，例如可在上样缓冲液中加入0~50mM的MgCl2。Mg2+也可以抑制填料与核酸等含磷酸基团物质的电荷互斥作用，加入Mg2+可以增强结合效果。

当形成的硼酸酯以不带电荷的平面三角形结构存在时，硼原子存在空轨道，可作为电荷转移相互作用的电子受体。未质子化的氨基是良好的电子供体，当氨基提供孤对电子给硼原子时，硼原子形成四面体型，促进硼酸酯的形成。但需要注意的是，当氨基附近有羟基存在时，填料与1,2-顺式二醇将无法形成硼酸酯结构。这也是为什么乙醇胺和Tris不适合作为NuPerley Boronate的上样缓冲液。

4 、使用方法参考

4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定体积。NuPerley Boronate的压缩比为~1.10。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽去液体，并用约3倍填料体积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液（原包装中填料体积分数为67%），使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器），为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

4.3  平衡与上样

在上样前，可用上样缓冲液（平衡缓冲液）在操作流速下平衡层析柱，观察检测器的变化，直到电导、pH 等参数不变。上样量根据样品的性质和层析介质的量进行选择，可在预实验中确定，例如静态吸附实验。一般需要将样品用上样缓冲液稀释，例如1：1稀释。

上样缓冲液pH通常为8.5~9.0，例如将糖蛋白从非糖蛋白中分离可用HEPES缓冲液（20mM HEPES, 20mMMgCl2,pH 8.5），从脱氧核糖核苷中分离核糖核苷可用醋酸铵缓冲液（0.25 M 醋酸铵, pH 8.8）。本填料常用的上样缓冲体系有磷酸盐、醋酸铵、HEPES等，一般情况下应避免使用含氨基的缓冲液，例如 Tris-HCl体系。

4.4 洗脱

用2-3个柱体积的平衡缓冲液冲洗上样后的层析柱，观察检测器的变化，直到电导、pH等参数不变，此时未结合的组分被清洗出去。

亲和层析柱的洗脱可用恒定洗脱、梯度洗脱或者阶跃洗脱。洗脱过程可以将pH降低至4~6，例如0.1M 甲酸、25mM盐酸；也可以选择糖类进行竞争洗脱，如10~200mM山梨-醇；也可以用0~20 mM的EDTA；Tris可作为高效洗脱剂。

4.5  再生与在位清洗（CIP）

通常可用5 C 的洗脱液将填料再生。若有失活蛋白质或脂类物质在再生时洗不掉可用在位清洗（CIP）除去。可采用以下选择进行在位清洗：0.5mol/LNaOH、70%乙醇、30%异丙醇等。在位清洗可有效去除介质上的杂质，反向效果更佳。

4.6 填料保存

填料的初始保存液为20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。也可以用0.2 M醋酸钠、0.1M甲酸等与洗脱、再生接近的缓冲液保存，缓冲液中可添加0.02%叠氮-化钠以防腐，在偏弱酸性的环境中填料更稳定。保存温度在2~8 ℃为宜，不可冻存。

3-氨基苯硼酸-琼脂糖