1 、产品介绍

PAG NUPharose FF是将重组蛋白A蛋白G融合蛋白（r-PAG,Nuptec NRPA14）键合在琼脂糖凝胶微球上形成的亲和分离介质。与单独的蛋白A或蛋白G分离介质相比，具有更宽广的结合范围，可以与人的所有IgG亚型、IgA、IgE、IgM结合，但不能与小鼠的IgA、IgM和血清白蛋白结合，适合用于鼠IgG单抗的提取和检测。同时融合后的r-PAG降低对pH的依赖，允许在pH5-8进行结合。

2 、产品特点与技术指标

注：a 90%体积以上的微球在此粒径范围；b DBC10%测试条件为：10%流穿，6min停留时间；c 推荐流速是指该流速可满足大部分柱高下2~6min停留时间的使用条件，并非只能在该流速范围内工作；d 10cm柱高下的测试流速。

3 、PAG 对各类抗体的亲和性

PAG NUPharoseFF对多种哺乳动物抗体的亲和性如下表所示，与单独的蛋白A或蛋白G分离介质相比，蛋白A蛋白G融合蛋白具有更宽广的结合范围。

4 、使用方法参考

4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全读取的稳定体积。PAGNUPharoseFF的压缩比为1.15。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约3倍填料体积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后， 用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。柱效测定可以采用丙酮或者NaCl作为样品进行，按照下表配制样品溶液和流动相。

根据UV或者电导率曲线计算理论塔板高度（HETP）、理论塔板数（N）和非对称 因子（As），公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2 As=a/b

其中：L为柱高；VR为保留体积；Wh为半高峰宽；a为在10%峰高处的个半峰宽；b为在10%峰高处的第二个半峰宽。

一般来说，HETP的数值应小于填料平均粒径的三倍（即HETP/D50<3 ，D50为填料的平均粒径），As应在0.8~1.5之间。

4.3  平衡与上样（Equilibration & Loading）

PB缓冲液（20mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是较为常用和通用的缓冲体系。初始的缓冲液称为平衡缓冲液，记为缓冲液A。

在上样前，需用缓冲液A在操作流速下平衡层析柱，该过程通常需要5~10个柱体积的缓冲液A，以电导、pH等检测信号参数不变且与缓冲液A对应为准。

上样量可按“mg目标蛋白/mL填料”来设定，通常为DBC10%的50~80%，例如PAG NUPharose FF产品对人IgG的DBC10%为~40mg/mL，上样量可控制为20~32mg/mL。在条件筛选阶段，也可以降低上样品，观察结合、特异性和洗脱情况。上样前需要对样品进行离心（10000 g以上）、过滤（0.22或0.45μm）处理，以免堵塞色谱柱。

上样后需要3~10个柱体积的缓冲液A再平衡层析柱。

4.4 洗脱与再生（Elution & Regeneration）

*-常用的洗脱方式为pH=2.5~3.0的甘氨-酸、柠檬酸盐或乙酸盐，该条件可基本将抗体完-全洗脱。但该pH较低，可能会使一些抗体失活或聚集，在条件筛选阶段可逐步降低pH，筛选出收率可接受、抗体不失活或不聚焦的pH。也可以将洗脱液收集在弱碱性的缓冲液中，中和至中性，以缩短低pH条件的接触时间。洗脱之后，可用5~10个柱体积的洗脱液对色谱柱进行再生。 

4.5 在位清洗（CIP）

多次使用后会有沉淀蛋白，强疏水性蛋白，脂蛋白，脂质体等非特异吸附凝胶上，可以用0.1%去垢剂短时间清洗，如0.1% Triton X-100清洗2个柱体积，立即用结合缓冲液洗5-10个柱体积。也可以用70%乙醇清洗作同样清洗。

4.6 填料保存

填料的初始保存液为20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在2~8℃为宜，不可冻存。